毕业设计作品模板(商检专业)

1、湖南外贸职业学院hunan international business毕业设计题 目姓 名学 号系 院专业班级指导教师年 月 日3摘要：3前言4一、孔雀石绿的性质5二、孔雀石绿的检测范围5三、孔雀石绿的应用四、孔雀石绿的副作用5（一）孔雀石绿对水生动物的毒性5（二）孔雀石绿对人和哺乳动物的毒性 五、酶联免疫吸附法（一）原理6（二）试剂和材料6（三）仪器和设备6（四）样品处理7（五）酶联免疫测定7（六）结果判定8（七）方法的检出限、回收率、重复性8（八）结果表述8六、注意事项9结论10水产品中孔雀石绿残留的快速检测摘要：水产品的安全问题日益成为社会关注的焦点，近年来，我国出口的鳗銚以及国内市场

2、 上的水产品都发现了孔雀石绿残留。国内各有关检测机构相继开展了水产品中孔雀石绿残留 的检测。本快速检测方法对酶联免疫吸附检测法作一概述，以便研究者在此基础上进一步改 进和发展。关键词：水产品、孔雀石绿、快速检测孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体,又名碱性绿.严基快绿,其既 是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色。长期以来，渔民都用它来预 防鱼的水霉病、鲤霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输 过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。科研结果表明，孔雀石绿在鱼内残留时 间太长，且其具有高毒性、高残留和致癌等副作用，鉴于此，许多国家均将孔雀 石绿列为水产养殖禁用药物。孔雀石绿

3、的性质孔雀石绿，分子式c23h25cln2,分子量：364.92 ,别名碱性孔雀石绿、品绿盐基块绿、碱性绿、盐基块绿、苯胺绿，为金属光泽的深绿色结晶状固体，极 易溶于水和乙醇。孔雀石绿是由苯甲醛和n ,n二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌存在的条件下缩合生成四甲基代二氨基三苯甲烷的隐性碱体后，在酸价质中被二氧 化铅氧化制得。孔雀石绿电离常熟(pk)为6.90o ph=4.0 ,电离完全,ph=6.9 ,电离50% , ph=7.4,电离25%o ph=10.1 ,无电离现象。孔雀石绿分工业用和试剂用两大类：工业用孔雀石绿价值低廉，但含有金属 化合物；试剂用孔雀石绿中有草酸盐、硫盐酸、盐酸盐和氯化锌复盐

4、4种，其中 氯化锌复盐(3c23h25cin2.2zncl2.2h2o )为黄铜色菱形结晶，以染料盐和甲醛或假碱两种离子形式存在，易溶于水，还有很强的脂溶性可以进入细胞，毒性最强。孔雀石绿的检测范本实验报告规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿残留量的酹 联免疫测定法，适用于鱼、虾以及鱼池或则鱼缸水样中的总的孔雀石绿残留量的检测。三、孔雀石绿的应用孔雀石绿以前主要用在工业上，制陶、印染、皮革、食品染色、生物染色等方面均有应用，而自1933年发现其对水产动物具有较好的药用作用后，主要用 于水产养殖中的水霉病和生物原虫的控制，是药用染料中抗菌效力较强的一类。后曾作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂被广

5、泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、 鲤霉斌和小瓜虫等，一些国家还用于控制细菌、线虫和吸虫等。另外，据调查目前孔雀石绿也作为一种消毒剂在广泛应用，具体为：(1 )运输工具消毒：活鱼贩运商为了延长鱼生存的时间，在运输前用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒。(2) 鱼池消毒：因为鱼从鱼塘到当地水产品批发市场，再到外地水产品批 发市场，要经过多次装卸和碰撞，容易使鱼鳞脱落。掉鳞会引起鱼体霉烂，引起 鱼很快死忙，因此储放活鱼的鱼池也采用孔雀石绿进行消毒。(3) 暂养消毒：酒店为了延长鱼的存活时间，也投放孔雀石绿进行消毒。 使用孔雀石绿消毒后的鱼即使死亡后颜色也较为鲜亮，消费者很难从外表分辨。四.孔雀石绿的副

6、作用（一）孔雀石绿对水生动物的毒性孔雀石绿能够溶解足够的锌，引起水生动物急性锌中毒；阻碍肠道霉（如胰 蛋白酶、a淀粉酶等）活性，影响水生动物的摄食与生长。1998年srivastava 试验发现孔雀石绿能使鱼体肝细胞增大、空泡化，从而导致坏死和肝硬化。1997 年周立红研究发现孔雀石绿可使鳞鱼和尼罗罗非鱼的红细胞产生微核，微核率随 药物浓度的升高而增加。孔雀石绿致使淡水鱼卵染色体异常。当孔雀石绿高于0.2mg/l时，对软体动物东风螺的受精卵或是幼体都有不同程度的发育畸形。试 验还证实了孔雀石绿能使虹鱒发生癌症。（二）孔雀石绿对人和哺乳动物的毒性孔雀石绿对哺乳动物细胞具有高毒性，研究发现孔雀石绿

7、能引起动物食物摄 入量、生长速度和生殖能力的降低，导致肝、肾、心脏、肺等脏器中毒，造成皮 肤、眼睛、肺和骨髓的损害。1999年culp试验发现孔雀石绿与无色孔雀石绿均 能使大鼠肝细胞空泡化，无色孔雀石绿还能使甲状腺滤泡上皮大量凋亡，减少公 鼠甲状腺激素的释放；还能抑制血浆胆碱酯酶的作用，进而有可能造成乙酰胆碱 的蓄积而出现神经症状。五.孔雀石绿残的检测酶联免疫吸附法（一）原理本孔雀石绿类酶联免疫检验试剂，主要是利用还原剂将样品中的孔雀石绿还 原成隐性孔雀石绿后，利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理来进行 的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中之隐性孔雀石绿对微孔中之抗体来进行竞争反应。

8、在整个反应当中，如果样品中之隐性孔雀石绿残留的越多，相对地 就会竞争掉越多的抗体，使得结合了与微孔盘上包被的抗原结合抗体的二次抗体 相对地就会减少。因此，反应中之酶标记物结合体底物溶液之呈色就会很淡， 甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应。反之，若样品中没有含隐性孔雀石绿，则 呈色会比较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。（二）试剂和材料2.k实验室用试剂：所用试剂除另有规定外，均为分析纯。水为符合gb/t6682 规定的二级水。2.2、乙酸乙酯。2.3、12n盐酸溶液 2.4、孔雀石绿酶联免疫试剂盒（三）仪器和设备3.1、酶标仪：配备450 nm滤光片。3.2、分析天平：感量0.0

9、01g ,感量0.0001g。3.3、恒温培养箱、均质器、旋涡振荡器、水浴锅、氮吹仪。3.4、离心机:离心力4000go3.5、微量单道/多道移液器:10pl - 10opl ; 10opl - 10oopl : 50pl300pl。3.6、聚四氟乙烯离心管：5ml , 100ml，具塞，量筒100ml。（四）样品处理4.1、鱼去鳞、去皮，沿背脊取肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分。称取5.00g样品于50ml离心管内，加入0.4%还原剂3ml 后立刻震荡1分钟使成肉浆状，静置30分钟。42再加入6ml 0.002n盐乙酸乙酯，震荡1分钟，以离心机离心1700xg（约

10、3500rpm)10 分钟。4.3、离心后若于上层有机层内观察到白色胶状物时，用竹棒或移液枪头搅拌上 层有机层后再次以1700xg（约3500rpm）离心10分钟，取3ml上层液（盐酸乙 酸乙酯）至10ml玻璃管中，于609下，利用氮气将有机溶剂吹干。4.4、于此玻璃管中加入正己烷1ml ,剧烈震荡将残余物完全溶解（若氮吹后的管 内有很多油脂时，可将正己烷加入量改为2mlo ）,缓缓加入1ml样品稀释液， 轻柔混合震荡（vortex） 1分钟。4.5、以离心机离心1700xg（约3500rpm） 10分钟，若离心后不能确实分层而在 两层问出现乳化层时，请置于沸水中隔水加热至上下确实分层，待玻璃

11、管冷却至 室温后再次以离心机离心1700xg（约3500rpm） 10分钟。用吸管吸去上层液（正 己烷），再吸取下层液（水层）备用。（五）酶联免疫测定5.1、使用前将试剂盒置于室温（2025°c）平衡30min以上，注意每种液体试剂使 用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入 自封袋，保存于2-8°c不要冷冻。5.2、于适当微孔分别加入100pl隐性孔雀石绿标准液。5.3、在另外的微孔加入100pl已完成前处理之样品溶液。5.4、再于每一微孔另再加入100pl的1倍隐性孔雀石绿抗体。5.5、轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。5.6

12、、将微孔中之反应液甩掉，再将300pl的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉， 重复此步骤洗3次。5.7、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。5.&于每一微孔加入100pl的1倍二次抗体。5.9、轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。5.10. 将微孔中之反应液甩掉，再将300pl的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉， 重复此步骤洗3次。5.1k最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。5.12、于每一微孔加入底物溶液100plo5.13、轻敲盘子四周，使其充分混合后室温卜反应20分钟。5.14、加入反应终止液，每一微孔加入100plo5.15、酶标仪以单波长450 nm或双波长450 nm/650 n

13、m判读。(六) 结果判定k定性判定用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含孔雀石绿浓度范围 (ng/ml)o假设样品1的吸光度值为0.313 ,样品2的吸光度值为1.032 ,标准液 吸光度值分别是:oppb 为 1.892 ;0.025ppb 为 1.501 ;0.05ppb 为 1.175 ;0.1ppb 为 0.751 j03ppb 为 0.421 ;06ppb 为 0.19&则样品 1 的浓度范围 0.3ppb-0.6ppb;样品2的浓度范围0.05ppb-0.lppbo （再乘以相应的稀释倍数）2、定量判定所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（b）除以第一个

14、标准（0 标准）的吸光度值（bo）再乘以100% ,即百分吸光度值。百分吸光度值%=b/b0x100%b_标准溶液或样本溶液的平均吸光度值。boong/ml标准溶液的平均吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以孔雀石绿标准品浓度（ng/ml）的半对数为 横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上 读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿的实际浓 度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。（七）方法的检出限.回收率、重复性7.1. 检岀限 本方法孔雀石绿及其代谢残留物的检出限为0.2pg/kgo7.2. 回收率 在样品中

15、添加0.1pg/kg4pg/kg浓度水平时，回收率为70% 120%o7.3. 重复性本方法的批内变异系数00% ,批间变异系数0%。（八）结果表述当所对应的样品的测定值小于其检出限时，报告为孔雀石绿未检出。当测定 值大于检出限时，报告为孔雀石绿检出。出现阳性值时(超过相关标准、规定的限量值)，需用液相色谱串联质谱法(lc/ms-ms )加以确证。六、注意事项(一)样本处理步骤(1 )实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。(2 )具，以避免实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器 污染干扰实验结果。对用氮气吹干的管子要预先干燥。(3) 乙月青、二氯甲烷、正己烷均有一定毒性，使用前必须做好防护措施。(4) 乙月青、二氯甲烷、正己烷均易挥发，所以每次加入试剂后均须盖好盖子。(5) 用枪加液时注意枪头是否松动，移液枪是否准确。用排枪时注意各个枪头 吸的液体是否一致，否则用手推紧枪头。(二)酶联免疫测定步骤(1 )室温低于20°c或试剂及样本没有回到室温(20-25°c会导致所有标准的0d(2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重 复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。(3) 每加一种试剂前需要将其摇匀。(4) 反应终止液为2m硫酸