肠道微生物DNA提取

1、土壤微生物中提取总dna实验概要从土壤微生物中提取总dna并纯化，高质址的dna可用于后续文库构建。主要试剂tenp 缓冲液(50 mmol/ltris, 20 mmol/l edta, 100 mmol/l naci, 1% pvp, ph 10.0)pbs 缓冲液(137 mmol/l naclz 2.7 mmol/l kci, 10 mmol/l na2hpo4/ 2 mmol/l kh2po4/ ph 7.4)dna 提取缓w1 液(100 mmol/l tris, 100 mmol/l edta, 100 mmol/l na3po4/ 1.5 m naci, 1%ctab, ph 8

2、.0) 蛋白酚 k(25 mg/ml) 溶菌酶(50 mg/ml, ph 8. 0)20% sds氯仿异戊醇异丙醇70%乙醇rnase 20 mg/mlqiaxii大片段凝胶回收试剂盒(qiagen)主要设备50ml、1.5 ml 离心管摇床高速离心机水浴锅电泳槽电泳仪涡旋仪实验材料土壤样品实验步骤1. 总dna提取：(1) 収2g 土样，置于50ml灭菌的离心管中；(2) 加入 10 ml tenp 缓冲液(50 mmol/l tris, 20 mmol/l edta, 100 mmol/l naci, 1% pvp, ph 10.0)悬浮 土样，200转摇床振荡lornin充分混匀；(3)

3、 10 000 r/min离心5 min,弃上淸，重复洗涤多次至上淸基木为无色；(4) 用 5 ml pbs 缓冲液(137 mmol/l naci, 2.7 mmol/l kci, 10 mmol/l na2hpo4/ 2 mmol/l kh2po4/ ph7.4)漂洗一次；(5) 沉淀加入 13.5 ml dna 提取缓冲液(100 mmol/l tris, 100 mmol/l edta, 100 mmol/l na3po4/1.5 m naq 1%ctab, ph 8.0),混匀后加入 100 pl 蛋白酶 k(25 mg/ml)和 200 yl溶菌酶(50 mg/ml, ph 8.

4、0),37°c 水浴30 min,每隔10 min颠倒混匀;(6) 加入2 ml20%sds, 65°c水浴2h,每隔20 min颠倒混匀;(7) 8 000 r/min室温离心15 min,取上清，用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次;(8) 水相屮加入0.6倍体积的异内醇，4°c沉淀过夜；(9) 11 000 r/min 4°c离心 20 min 收集 dna 沉淀；(10) 70%乙醇漂洗两次,干燥后用100 |1l ddh2o(含rnase 20 mg/ml)溶解,转入1.5 ml离心管。2. 总dna纯化：(1) 配制0.8%琼脂糖凝胶；(

5、2) 每个上样孔加入50 |1l粗dna,进行低电压长时间电泳(4°c, 25 v, 8 h)；(3) 电泳结束后，切下主带所在的凝胶(胶的体积尽对能小)；qiaxii大片段凝胶回收试剂盒(qiagen)回收:加入3倍体积的buffer qx i及适量的qi ax ii (glassmilk),55°ciu浴10 min,每隔2 min轻轻用手指弹起沉淀(回收人片段时不要涡旋)，待凝胶完全溶解，12 000 g离心1 min,弃上清;再加入500 |1l buffer qx i洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶:再用500 pl buffer pe 洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适

6、当体积的ddh2o,离心后收集上淸，琼脂糖凝胶电泳确定冋收效 率。肠道微生物dna的提取实验概要肠道微生物dna是进行微生物分子生态学研究的前提。能否获得高的dna提取率和高质量 的dna,从而真实地反映微生物群落的实际情况，是保障研究结果是否可靠的关键。如何 获取高质量、较完整的肠道菌群基因组dna是肠道微工物研究中的关键。木研究采用物理 方法，化学方法，酶解法等进行dna提取，并对其进行比较，经过优化得到最佳的提取方 法，使其符合以后pcr扩增要求以及其它后续研究工作。试验结果表明用液氮研像加ctab 提収液的方法提収的肠道微牛物总dna的效果高于其它方法。并口通过电泳以及pcr检测, 所

7、提取的dna的质量适于进一步的分了生物学研究。实验材料健康成年对虾购于市场，挑取生氏较好、大小均一的，于超净台下取肠道，无菌操作。实验步骤1. dna提取方法方法a：1) 取0.02g虾肠加入总filmlpbs匀浆,液氮研磨2) 加入 250ul0.5%tween-80,吹打洗脱 3min3) 300g离心5min,取上清4) 10000g离心lomin,弃上清5) 加入250uldna裂解液，涡旋混和器上混合30s6) 65°c水浴20min,期间每5min混合一次7) 12000g离心15min,取上清8) 加等体积酚/氯仿,14000g离心15min,取上清9）加入2.5倍体积

8、异丙醇,-20°c静置l-2h10）4°c 14000g 离心 15min,弃上清11）加入300ul70%预冷乙醇,14000g离心lomin,弃上清12）超净台下干燥，力口 50ulte重悬，冻于80c方法b：1）取0.02g虾肠，加130ulctab提取液，冰浴超声100w, 5min2）放入液氮中冰冻20min,迅速放入65°c水浴中5min,重复3次3）放入37°c摇床，加10ul溶菌酶,振荡30min4）力ii 15ul20%（w/c）sds65°c温育 2h5）4°c 3200g 离心 lomin,取上清6）加 1 oo

9、ulctab 液和 25ul20%sds,涡旋，65°c温育 lomin7）3200g离心,取上清8）加等体积酚/氯仿,14000g离心15min,取上清9）加0.7倍体积异丙醇，20°c静置l2h10）4°c 14000g 离心 15min,弃上清11）加入300ul70%预冷乙醇,14000g离心lomin,弃上清12）超净台下干燥,加50ulte重悬,冻于-80°c方法g1）取0.02g虾肠,液氮研磨,加入总量imlpbs和20ul20%pvpp匀浆2）200g离心6min,取上清,沉淀中加iml pbs离心取上清,合并上清;300g离心6min,

10、 取上清3）1200g离心6min,收集菌体,并用pbs洗涤4）得到的菌体中加入300ul裂解液i, 10%溶菌酶looul, 1% rnase 20ul,混匀后37°c保 温 30min5）加入 300ul 裂解液 ii, 50ul20%sds, 50ul20% pvpp,混匀冰浴 5min6）加等体积酚/氯仿,13000g离心8min,取上清,重复1次刀加入2倍体积异丙醇和1/10倍体积3m醋酸钠，20°c沉淀2h8）4°c 14000g 离心 15min,弃上清9）加入600ul70%预冷乙醇，14000g离心lomin,弃上清10）超净台卜干燥，加50ul

11、te重悬，冻于-80°c优化ctab法：1）无菌条件f剖取对虾肠道，放入无水乙醇中，冻于80°c2）取虾肠（0.02g左右）,液氮研磨,加入总量imlpbs和20ul 20% pvpp, 0.5% tween-80, 吹打洗脱3min3）200g离心6min,取上清,沉淀中加imlpbs离心取上清,合并上清;取上清4）1200g离心6min,收集菌体,并用pbs洗涤5）得到的菌体中加130ulctab提取液和10ul溶菌陋，放入37°c摇床，6) 加 15ul20%(w/c) sds 和：loul 蛋白酶 k, 65°c水浴 2h7) 4°c

12、3200g离心lomin,取上清匀浆;加入250ul300g离心6min,振荡30min8) 力0 looulctab 液和 25ul20%sds,涡旋，65°c水浴 lomin9) 3200g离心,取上清10) 加等体积酚/氯仿,14000g离心15min,取上清11) 加0.7倍体积异丙醇，20°c静置lh12) 4°c 14000g 离心 15min,弃上清13) 加入600ul70%预冷乙醇,14000g离心lomin,弃上清14) 超净台下t燥，加50ulte重悬，冻于-80°c备用2. dna浓度测定和电泳检测所捉dna用1%琼脂糖凝胶电泳检测。用紫外分光光度计于260nm, 280nm波长下测定粗提 dna的吸光值及浓度，计算ill a260/a280值。用1%琼脂糖凝胶电泳检测。3. 肠道微生物dna的pcr检测pcr引物为接近全长的细菌通用引物:27f(5,-agagtttgatcmtggctc-3,； m=a或c)； 13878 (5'-gggcggwgtgtacaaggc-3'； w=a 或 t)。将捉収到的基因组dna稀释20倍后分别収1, 2, 4, 8ul和原样lul, 2ul作为模板。pcr 反应体系是：无菌双蒸水 34.5ul, 10xpcr 缓冲液 5ul, 2.5 mmol/ldn