鸭β-防御素9（AvBD9）单克隆抗体的制备及鉴定{精编资料}

1、农业生物技术学报，年，第卷，第期,研究资源鸭一防御素单克隆抗体的制备及鉴定李子瑞邵昱昊韩宗玺刘晓丽刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所,哈尔滨；中国农业科学院哈尔 滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，哈尔滨通讯作者，.摘 要本研究旨在制备抗鸭一防御素蛋白的单克隆抗体。首先 用 载体表达的鸭蛋白做抗原免疫周龄雌性/小鼠，免疫 次，每次间隔，融合前加强免疫次。然后将鸭 基因亚克隆到原核表达载体的和双酶 切位点上，构建重组表达质粒 ，将重组质粒转化至大肠杆菌一株，经诱导表达、镰柱纯化后做检测原。用间接酶联免疫吸附实验和 相结合的方法进行筛选及鉴定，经 次亚克隆后得到株单抗，命名

2、为。结果表明：重组.？ 蛋白大小为，与预期大小一致，并能被抗？阳性血清识别。单抗在 一.空载体蛋白、蛋白、？蛋白、.蛋白中能够特异性识别 蛋白。其亚类鉴定重链为,轻链为链。本研究获得了株鸭 蛋白的 单克隆抗体，单抗 的特异性良好，可用于对鸭 蛋口的生物学功能及 活性作进一步研究。关键词 鸭，。，单克隆抗体?,;,:,?,/ / 一 一?肋一?,?,?-基金项耳：本研究rti国家自然科学基金资助收稿日期：.接受日期：.农业生物技术学报。 刪，？，一？，禽抗菌肽属一防御素类，为防御素三大亚类结果与分析、和之一,在禽的先天性免疫和获得性免疫中.鉴定均发挥重要作用,具有广谱的抗细菌、抗真菌、抗病毒和免

3、疫增强作用。其分子中氨基酸残基数量为 和酶切质 粒, 个.，。禽一防御素的主要回收大小为目的片段亚克隆到原 核表达载体分子特征为含有 个半胱氨酸残基组成的三对二硫中，经和酶 切图鉴定止确后，得到的重组质粒为。键,分别在一、 一和一处配对连接形成，富含精氨重组蛋白的表达和纯化 具有亲水性和亲脂性、特征性片层结构马得莹将鉴定正确的重组质粒转化到中，经等，。迄今为止，已从鸡，；在°c诱导表达,？结果显示: 在;，；，；处可见 条比较明显的蛋白带，与预测蛋白带 的，,;，；大小一致。结果表明：重组蛋白可以与，、火鸡，；，本研究制各的抗鸭 的阳性血清反应,而与空、鸵鸟，；，； 载体不反应图。，

4、、企鹅，以及鸭等禽类体内发现了 多种禽一防御素。目前，在鸭阳性杂交瘤 细胞筛选结果体内只发现了个防御素，分别为鸭廖以纯化的.蛋白为检测抗文艳等,、鸭廖文艳等，和鸭原，杂交瘤细胞上清为一抗，图和间王瑞琴等，。重组鸭蛋 白廖文接 图方法进行筛选，最终得到株稳定分艳等，对多种细菌有抗菌活性。鸭基泌的杂交瘤细胞株,命名为。因在不同口龄鸭组织屮都有表达，特别是在消化系的亚类鉴定统与免疫系统中广泛分布，并且随着日龄的增长，其表达范围越广。鸭 基因在鸭免疫器官中按亚类鉴定试剂盒说明进行单抗的广泛表达显示，该小分子多肽 在体内除了抗菌作的亚类鉴定，结果显示其重链为，轻链为链。用外，在先天性免疫方面也发挥重要作

5、用。因此，进讨论步开展鸭在蛋白质水平的研究具有极为重要的意义。目前为止，禽防御素的研究与检测防御索的生物学效应展示了其在畜牧业、疾病还仅停留在转录水平上，检测的灵敏度和准确性都治疗等领域广阔的应用前景，因此有望成为-种新不是很高,而且检测手段也相当繁琐。因此,需耍寻型的抗生素。由于天然防御素在生物体内表达量有找一种灵敏度高，准确性好，特异性强的检测方法。限,直接提取远不能满足需要。通过基因工程手段获单克隆抗体的制备无疑是最好的选择。而关于鸭得防御素是目前最为有效途径。以抗菌肽基因的克蛋白的单抗制 备国内外尚未见到报道。本隆为基础,选择合适的表达宿主，可以通过基因重组研究用一 载体表达的鸭 蛋白

6、做抗的方法体外大量表达抗菌肽马得莹等，。由于 原，免疫周龄雌性/小鼠。用禽防御素分子量小，抗原决定簇少，直接免疫小鼠很载体表达的鸭蛋白经银柱纯化后做检测难以产生免疫反应，使用原核表达并经过纯化的重原。采用常规的单克隆抗体制备技术制备抗鸭组蛋白作为免疫原，能诱发机体产生较高的抗体分蛋白的单克隆 抗体，通过间接和泌能力，解决了防御素免疫受限的问题。本研究利用 方法筛选得 到了一株针对鸭了大肠杆菌系统表达的标签的重组蛋白做抗的单克隆抗体。原免疫/小鼠，由于标签相对于防御素鸭防御素 单克隆抗休的制备及鉴定？、？和双酶切鉴定图鸭单克隆抗体特异性鉴定产物:/双酶切产物:蛋白；：？蛋白；：一？蛋白；：蛋白；

7、：蛋白;蛋白；：蛋白相对分子质量标准 ？：一 一 ;:?;q . q /:重组蛋白的与检测结果重组蛋白的 鉴定：空载体 图单克隆抗体 的 特异性鉴定；：诱导前；：纯化的重组蛋白；：诱导后蛋白：和对分子质量标准.制的株单克隆抗体在鸭、鸭、鸡/.;:中能特异性识别鸭，所以该单抗所；：；：一 ？；： 针对的抗原决定簇极有可能是鸭 所特有的。【:高质量的防御素单克隆抗体的制备对防御素生物学活性的研究和建立鉴定方法具有深远意义。不仅为刍较大，容易产生针对标签的抗体，因此，将鸭建立检测技术检测天然、建立亲和层基因克隆到原核表达载体一中，将此析纯化方法以及研究营养物质和细胞因子对鸭且蛋白作为筛选的检测原,这

8、样有效的避免了假基因表达的影 响及调控提供了技术方法，同主的产生。时也能对 在细胞内的表达与分布、蛋白质结本实验在细胞融合前用/的一杂氮鸟构与功能及其在免疫反应中的应答机制和体外抗菌令处理/,防止缺乏酶的细胞发牛逆jiff实验等诸多反面进行分析。达到去除返祖细胞和曾强细胞对的敏感性 的。细胞融合时米用对细胞损靑较小且融合率 材料与方法 蔷的 为融合剂，以利于细胞融合。材料浊合初期，为克服阳性杂交瘤细胞系不稳定的现我们及时对其进行克隆化。菌株和质粒载体:大肠杆菌、鸭、鸭、鸡 在氨基酸组？和骨髓瘤细胞/由本实验室保存。 匕和似性很高，本研究用杂交瘤技术制备了抗鸭？廖文艳 等，.的单克隆抗体，特异性

9、实验结果表明：所研 廖文艳 等，,?。维素膜上。按 常规方法进行 封闭过廖文艳等，重组质粒由本实验室制备保存。夜，一抗为鼠抗？蛋白的阳性血实验用动物清,二抗为羊抗鼠。显色试剂为。若干只雌性/小鼠周龄单克隆抗体的制备左右，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动杂交瘤细胞阳性细胞株的筛选及鉴定物中心供给。取骨髓瘤细胞/与经过免疫的/小 工具酶与主要试剂鼠脾细胞按：混合,按常规细胞融合方法进行融 聚合酶、核酸内切酶和、合。以纯化的.？为检测原，用连接酶均购自公司大连羊 和间接相结合的方法进行筛选,抗鼠 酶标结合物；抗体亚类鉴定试剂盒;弗阳性细胞经过 次克隆化，直到所有克隆化的细胞氏不完全佐剂和列氏完

10、全佐剂来口检测阳性率为，成功制备了稳定分泌的公司美国;邻苯二胺、培养基、二氨基联苯杂交瘤细胞株。胺、聚乙二醇、胎牛血清等购自以一蛋白、蛋白、公司美国；原核表达载体一、蛋？蛋白、一蛋白、？白纯化试剂盒为公司产品德国。蛋白和？蛋白动物免疫进行？电泳，电转移至 膜上，以上述制备的单克隆抗体为一抗,二抗为标记的羊抗鼠以纯化后的蛋白作为抗原，显色检测。免疫/小鼠，经过 次免疫，每次间隔，以蛋片、蛋白、第一次免疫为抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合，一蛋白、一 蛋白、？第二和第三次抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混蛋白和？蛋白合,免疫剂量为每只小鼠，免疫部位为皮下多进行？电泳，割胶纯化后孔包点注射。进行融合前加强

11、免疫一次，用抗原直接被过夜，按 常规方法进行。一抗:杂交瘤细腹腔注射，剂量为每只。胞培养上清，二抗:加一羊抗鼠，显色:加邻重组质粒构建爪二胺 底物显色，终止读数:加入/,读取各孔值。 和酶切？ 质粒,单克隆抗体腹水的制备回收大小为目的片段，同时将一空载体用同样的酶处理，将回收的片段连接到一在接种杂交瘤细胞的 前天，先给经产的载体中，转化大肠杆菌 感受态细胞。采用已设/小鼠腹腔注射 弗氏不完全佐剂/只。计好的表达引物廖文艳等，以次日腹腔注射分泌抗体的杂交瘤细胞 个/只，质粒为模板,对 提取的质粒进行鉴定，每只小鼠腹腔注射细胞悬液,待小鼠腹部明然后对重组质粒进行双酶切鉴定，阳性质粒命名为显膨大后，收集腹水,一只小鼠一