固体分散体技术对纳米雄黄稳定性和体外溶出影响探究

1、固体分散体技术对纳米雄黄稳定性和体外溶出影响探究摘要目的：制备纳米雄黄固体分散体以提高纳米 雄黄的稳定性及体外溶出度。方法：分别以聚乙二醇6000 (peg6000).泊洛沙姆188 (f68)为载体，采用熔融法制备 纳米雄黄固体分散体并用x-射线衍射法、显微观察鉴别药物 在载体中的存在状态。采用二乙基二硫代氨基甲酸银分光光 度法对as203进行含量测定并进行稳定性考察试验，采用氢 化物原子吸收分光光度法进行含量测定，对固体分散体中碑 的体外溶出进行考察。结果：x-射线衍射和显微观察结果显 示，纳米雄黄以无定型状态存在于固体分散体中，2种载体 的固体分散体均能增加纳米雄黄中碑的溶出量和溶出速度

2、 并减少纳米雄黄的团聚和as203的含量。结论：以f68为载 体制备的固体分散体能显著提高纳米雄黄的稳定性和体外 溶出度。关键词纳米雄黄；固体分散体；稳定性；溶出度收稿日期2013-06-07基金项目 教育部新世纪优秀人才支持计划项目 (nect08-0898)；上海市教委重点学科项目(j50302)；上 海市优秀学科带头人项目(10xd1403900)通信作者*冯年平，博士生导师，tel: (021) 51322198,e-mai1: npfenghotmai1 com作者简介郭腾，博士研究生，从事中药新型给药系统 研究，tel: （021） 51322449, e-mail： guoten

3、glhotmail. com 中药雄黄的主要成分为as2s2和as4s4,并夹杂少量as203 和其他重金属盐，传统医学认为雄黄具有解毒、燥湿、祛痰、 截疟等作用。现代医学研究表明，雄黄还具有抗肿瘤作用， 大量文献报道了中药雄黄对恶性血液病、多发性骨髓瘤、宫 颈癌及子宫颈癌前病变等的治疗研究1-2,其抗肿瘤机制 包括诱导凋亡、抑制增殖、促进分化等3-5 o但雄黄的主 要活性成分as2s2水溶性差，体内难以吸收，导致其生物利 用度低、临床使用量大，从而影响了治疗效果。纳米技术已经被运用于提高雄黄的疗效，近年的研究表 明，经纳米化后，雄黄体现出更佳的抗肿瘤作用6。同时, 雄黄到达纳米级后也带来了其

4、他需要解决的问题，粒径减 小，导致其比表面积增加，更加容易发生氧化反应形成as2o3 从而带来毒性7；另外，纳米雄黄粉极易发生团聚，限制 了其临床使用效果。本课题通过固体分散体技术来提高纳米 雄黄的抗氧化性，增加纳米雄黄的稳定性，降低其毒性的同 时不影响其活性。1材料行星式球磨机（pm 100型，德国rersch）；原子吸收分 光光度计（990afg,北京普析通用有限公司）；紫外-可见分 光光度计（uv765,上海精科）；sartorius天平（cp225d, 德国）；5804r 台式离心机（eppendorf,德国）；nano zs90 zetasizer 粒径/zeta 电位测定仪（mal

5、vern,英国）；rc-806 溶出度仪（天津天大天发科技有限公司）；x-射线衍射仪（rigaku,日本）；eclipse 80i 数码显微镜（日本 nikon）；ds-r订数码成像系统（日本nikon）0雄黄（湖南石门）；碑标准溶液（用as203配制，国家 标准物质中心）；聚乙二醇6000 （peg6000,国药集团化学试 剂有限公司）；泊洛沙姆188 （f68,德国巴斯夫有限公司）； 其余试剂均为分析纯。硫腺-抗坏血酸溶液：称取硫腺、抗坏血酸各5 g,用蒸 馄水溶解并定容至100 ml,配成50 g - l-1的溶液，现用现 配。硼氢化钾溶液：称取硼氢化钾5 g溶于20 g l-1氢氧 化

6、钾溶液500 ml中，配成10 g l-1的溶液，现用现配。稀盐酸：取盐酸234 ml,加水稀释至1 000 ml,即得。碘化钾试液：取碘化钾16.5 g,加水使溶解成100 ml, 即得。本液应临用前新鲜配制。酸性氯化亚锡试液：取氯化亚锡20 g,加盐酸使溶解成 50 ml,滤过，即得。本液配成后3个月即不适用。二乙基二硫代氨基甲酸银试液：取二乙基二硫代氨基甲 酸银0. 25 g,加氯仿适量与三乙胺1.8ml,加氯仿至100 ml, 搅拌使溶解，放置过夜，用脱脂棉滤过，即得。本液应置棕 色玻璃瓶内，密塞，置阴凉处保存。标准碑溶液：准确称取as203 0. 132 g,置1 000 ml量 瓶

7、中，加20%氢氧化钠溶液5 ml溶解后，用适量的稀盐酸中 和，再加稀盐酸10 ml,用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备 液。临用前，精密量取贮备液10 ml,用水稀释至刻度，摇 匀，即得（每1 ml相当于1卩g的as）。上述试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。2方法2. 1 as203分析方法的建立采用2010年版中国药典碑盐检查法测定中的二乙 基二硫代氨基甲酸银法8。2. 1. 1标准曲线的制备 精密量取as203标准溶液1,5, 10, 15, 20 ml （相当于 1, 5, 10, 15, 20 ug 的 as）分别 放入100 ml标准磨口锥形瓶中，加盐酸5 ml与水21 ml, 再加碘

8、化钾试液5 ml与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放 至10 min后，加锌粒2g,立即安上装有醋酸铅棉导气管的 瓶塞，导管通入盛有5 ml ddc-ag液的吸收管中，反应45 min, 取出，用氯仿补至5 ml,混匀，置1 cm吸收池中以二乙基 二硫代氨基甲酸银液为空白，用分光光度计在510 nm处测 定吸光度，以吸光度（y）对质量浓度（x, mgl-1）进行 线性回归，求得标准曲线方程y=0. 012 8x+0. 002 6 （r=0. 9986),线性范围0.020. 0 mg l-1。2. 1. 2样品的测定 精密称定样品粉末0. 2g,加稀盐酸20 ml,搅拌30 min, 滤过，残渣用

9、稀盐酸洗涤2次，每次10 ml,搅拌10 min。 洗液与滤液合并，置100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀， 精密量取2 ml,其余操作同as2o3标准溶液。2.2 as2s2分析方法的建立采用氢化物原子吸收分光光度法测定。2. 2. 1测定条件 测定波长193. 7 nm；光谱带宽0. 4 nm； 负高压535 v；灯电流6 ma；灯元素as；燃气流量200 ml min-1；燃烧器高度10 mm；燃烧器位置3 mm；载流0. 9% 盐酸。2. 2.2标准曲线的制备 精密量取as203标准溶液适量, 加入硫腺-抗坏血酸溶液1 ml,用去离子水稀释配制质量浓 度为1, 2, 4, 8, 10

10、ugl-1的碑标准液，用氢化物原子 吸收分光光度计测定吸光度，以吸光度(y)对质量浓度(x, u g l-1 )进行线性回归，求得标准曲线方程为 y=0. 026x+0. 038 ( r=0. 999 3 ),线性范围 0. 0 10. 0 u g l-lo2. 3纳米雄黄的制备与表征2. 3.1纳米雄黄的制备按文献报道方法9,采用高能 球磨机湿磨法制备纳米雄黄。将块状雄黄粉碎过筛，得粗颗 粒，按球料比40 ： 1投入至球磨罐中，加入饱和十二烷基硫 酸钠溶液(sds)loml作为球磨介质，球磨转速400rmin-1, 正转30 min,停3 min,反转30 min,球磨12 h取出得到 纳米

11、雄黄。2. 3. 2纳米雄黄的炮制 采取水飞法对纳米雄黄进行炮 制去毒。取10 g纳米雄黄置研钵中，加蒸馆水5 ml,研磨 5 min呈糊状，再加蒸馆水100 ml搅拌1 min,静置2 min, 倾取混悬液，下沉的粗粉继续研磨，如此反复操作11次， 最后用剩余水冲洗研钵，合并各次混悬液，静置24h,倾去 上清液，抽滤即可。2. 3.3粒径与zeta测定 取少量纳米雄黄，超声分散于 适量乙二醇中，利用malvern粒径测定仪测定其粒径；另取 少量纳米雄黄分散于去离子水中进行zeta的测定。2. 3.4形态考察利用透射电镜对纳米雄黄的外观形态 进行观察。纳米雄黄经适量蒸馆水稀释后，取适量滴加至铜

12、 网上，自然干燥约10 min,放至透射电镜下进行观察。2. 4样品的制备2. 4. 1纳米雄黄固体分散体的制备采用熔融法制备纳 米雄黄固体分散体。按设计比例(质量比1 ： 5)称取经炮制 的纳米雄黄粉和载体材料(peg6000, f68),先将载体材料 置蒸发皿中，水浴加热至一定温度熔化后，投入纳米雄黄粉, 高剪切搅拌一定时间，迅速将样品转移至冰浴冷却，于真空 干燥箱内干燥过夜，粉碎后过80目筛，得到纳米雄黄固体 分散体，最后放入干燥器中室温陈化48 h备用。2. 4. 2物理混合物的制备将纳米雄黄与载体材料 peg6000, f68分别按质量比1 ： 5于研钵中研细，混匀后过 80筛，即得

13、，备用。2.5固体分散体的鉴别2. 5. 1 x-射线衍射 将纳米雄黄，peg6000, f68,物理 混合物及固体分散体进行x-射线衍射分析。辐射源cu-ka； 扫描范围2 0 2°50° ；扫描速度5°min-1。2. 5.2显微镜法将纳米雄黄，peg6000, f68,物理混 合物及固体分散体用甘油分散于载玻片上，盖上盖玻片后， 置于光学显微镜下（物镜40倍，目镜10倍）观察。2. 6稳定性考察2. 6. 1纳米雄黄粒径稳定性将制备的纳米雄黄室温下 避光存放于干燥器中，于第1, 2, 3, 10天分别取样，测定 其粒径。2. 6.2各组雄黄as2o3含量稳定

14、性将雄黄粗粉、纳米 雄黄、纳米雄黄的peg6000固体分散体（质量比1 : 5）、纳 米雄黄的f68固体分散体（质量比1 : 5）室温下存放至干燥 器中（不避光），于第7天取样，按2. 1. 2项下条件测定as2o3 含量。2.7体外溶出考察2. 7. 1碑溶出量的测定分别精密称取雄黄粗粉和纳米 雄黄各1 g,纳米雄黄的peg6000固体分散体（质量比1 : 5） 和纳米雄黄的f68固体分散体（质量比1 ： 5）适量（均含纳 米雄黄lg）,分别置于往复式水浴恒温振荡器中，加人工胃 酸溶液60 ml作为溶出介质，（37±05）匸水浴震荡36 h 后，取样10 ml,离心取上清液用0.

15、45 11 m滤膜过滤，精密量取100 ul置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，按2.2. 1 项下条件测定as2s2含量并计算其神溶出量。2. 7.2神溶出速度的测定 参考文献方法对各组雄黄的 碑溶出速度进行考察10 o精密称取雄黄粗粉和纳米雄黄各 3 g,纳米雄黄的peg6000固体分散体（质量比1 ： 5）和纳 米雄黄的f68固体分散体（质量比1 ： 5）适量（均含纳米雄黄3q,分别置于溶出试验仪中，加人工胃酸180 ml作为溶出介质，采用小杯法，（37±0.5）°c,搅拌转速120 r - min-1,分别于 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 6

16、0, 80 min抽取样品液2 ml,并补加同温空白介质2 ml,样品离心后取上清液用045 uni滤膜滤过，精密量取100 ul置10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，按2.2.1项下条件测定as2s2含量并绘制溶出曲线。3结果3. 1纳米雄黄的粒径与zeta测定在测定粒径时为了起到更好的分散效果，本研究将纳米雄黄超声分散于适量乙二醇中。结果见图1,纳米雄黄的平 均粒径为(85. 4±3. 5) nm, zeta 电位为(-34. 3±1. 7) mv, 表明纳米雄黄粒子表面带负电。图1纳米雄黄的粒径(a)与zeta电位(b)测定图fig. 1 particle size (

17、a) and zeta potential (b) of realgar nano-particles3.2纳米雄黄形态考察纳米雄黄的透射电镜(tem)观察结果见图2o纳米雄黄 近球型，分布均匀。图2纳米雄黄的tem图fig. 2 tem images of realgar nano-particles3.3 x-射线衍射分析(xrd)xrd试验结果见图3,纳米雄黄的结晶衍射峰明显，2种 物理混合物亦出现微弱衍射峰，固体分散体的结晶衍射峰均 消失或减弱，峰形和载体基本一致，提示在形成固体分散体 以后，由于载体对药物的抑晶作用，使药物以无定形状态高 度分散在载体材料中，还有一小部分可能是以微晶状

18、态存 在。3.4显微镜检查显微观察结果见图4,纳米雄黄为棕黄色微晶，peg6000 为不规则形状的结晶粉末，f68为球状或a.纳米雄黄；b. peg6000； c. peg6000 sd (1 ： 5)； d.纳米雄黄与peg6000物理混合物(1 ： 5)； e. f68； f. f68 sd (1 : 5)； g.纳米雄黄与f68物理混合物(1 : 5)o图3 x-射线衍射图谱fig. 3 the x-ray diffraction不规则颗粒，在peg6000及f68与纳米雄黄的物理混合 物中分别见到纳米雄黄与载体材料只是简单混合，未发生变 化。纳米雄黄固体分散体均为干燥后研碎获得的粉末，

19、因此 呈现不规则的块状，在光学显微镜下可以清楚地看到纳米雄 黄的棕黄色微晶分散在无色透明的载体当中，纳米雄黄与载 体材料均匀地融合在一起，纳米雄黄可能以无定形式分散于 载体材料中。a.纳米雄黄与peg6000物理混合物(1 : 5)； b.纳米 雄黄与 f68 物理混合物(1 : 5)； c. peg6000 sd (1 ： 5)； d. f68 sd (1 ： 5)o图4纳米雄黄固体分散体的显微镜图fig. 4 microgram of solid dispersions of realgar nano-particles3. 5纳米雄黄粒径稳定性纳米雄黄粒径稳定性考察结果表明，随着时间的推

20、移， 纳米雄黄粒径有逐渐增大的趋势，10 d后平均粒径(218. 5±4. 2) nm,已达到原来的2倍以上，证明纳米雄 黄在储藏过程中具有团聚现象。3. 6各组雄黄as203含量稳定性各组雄黄as203含量稳定性结果见表1,结果表明纳米雄黄中as203含量在7 d内较其他3组明显增加，纳米雄黄 固体分散体中as203的含量在7 d内与纳米雄黄组和雄黄粗 粉组相比较为稳定。证明雄黄纳米化后容易发生氧化现象， 通过固体分散体技术将纳米雄黄包裹后可以避免纳米雄黄直接暴露于空气和光照中,从而起到增加稳定性的作用,用f68制备的固体分散体能更好地提高纳米雄黄的抗氧化 性，增加纳米雄黄的稳定性

21、。表1各组雄黄as203质量分数table 1 content of as203 in different groups of realgarmg g-13. 7各组雄黄碑溶出量的测定雄黄粗粉、纳米雄黄和纳米雄黄固体分散体中as2s2溶 出量的结果见表2,结果表明将雄黄纳米化后神溶出量可达 常规雄黄粗粉中神溶出量的7. 7倍，纳米雄黄的peg6000, f68固体分散体中碑溶出量显著增加，纳米雄黄的f68固体 分散体的碑溶出量增加更为明显。表2各组雄黄碑溶出量table 2 dissolution amount of arsenic in differentgroups of realgarm

22、g g-13.8各组雄黄碑溶出速度的测定雄黄粗粉、纳米雄黄及其固体分散体中as2s2溶出曲线 见图5。雄黄粗粉中as2s2的溶出速度较慢，20 min前几乎没有溶出，80 min累积溶出量勉强达到0. 1 mgg-lo与雄 黄粗粉相比，纳米雄黄中as2s2的溶出速度较快，10 min时 溶出量即超过0. 1 mg g-1, 80 min累积溶出量为雄黄粗粉 的9. 4倍。而2种固体分散体均可大大提高纳米雄黄的神溶 出量，f68固体分散体的效果更好，在80 min时peg固体分 散体和f68固体分散体的碑溶出量分别达到4.347, 7. 354 mg g-1,是纳米雄黄的5.0, 8. 5倍，表

23、明固体分散体可以 显著提高纳米雄黄的碑溶出量；而在5 min时2种固体分散 体的碑溶出量已达0. 371, 0. 594 mg旷1,分别是纳米雄黄 的4. 3, 6. 9倍，表明本试验制备的固体分散体不仅提高了 纳米雄黄的碑溶出量，还提高了初期的溶出速度，证明固体 分散技术确是提高难溶性药物溶出度的有效手段。a.雄黄粗粉；b.纳米雄黄；c. f68 sd (1 : 5)； d. peg6000 sd(1 : 5)o图5各组雄黄碑溶出曲线fig.5 dissolution curves of arsenic in different groups of realgar4讨论目前，国内有很多专家开

24、展了纳米雄黄的研究11-15 o 通过纳米化，可改善雄黄的溶出性能，提高其生物利用度， 从而增加其临床疗效。但是对于纳米雄黄的研究过程中忽略 了 2个比较重要的方面：在球磨的过程中，机械力传输了大量的动能给纳米雄黄，导致纳米雄黄具有二次团聚的可能; 雄黄被纳米化后理化性质发生改变，尤其是粒径大幅减小,暴露于空气或光照中的雄黄粒子表面积会明显增加,这就会导致雄黄主要成分as2s2容易氧化成as203o上述不稳定因 素对临床用药的安全性造成了威胁。也正是基于上述2点的 考虑，本文研究了固体分散体技术对纳米雄黄稳定性及体外 溶出的影响。而由于雄黄难溶于水和有机溶剂，故采用熔融 法制备纳米雄黄固体分散

25、体。从纳米雄黄固体分散体的体外溶出试验结果可以看出， 纳米雄黄与2种载体制成固体分散体后碑溶出量均提髙，其 中f68作为载体，纳米雄黄的碑溶出量提高更大。可能是由 于f68具有高亲水性且熔点低，在熔融状态下易与纳米雄黄 形成分子胶体或超细状态的高分散体，使纳米雄黄在固体分 散体中以无定型或分子形式存在，大大增加其溶解时的表面 积，固体分散体技术也大大减少了纳米雄黄的再聚集和结 块，并增加了雄黄的润湿性。由于as2s2性质较为特殊，作为矿物药其在水相及有机相中的溶解性能均较差。在进行体外释放预试验时，笔者曾 考察了 as2s2在人工胃酸、人工肠液、05%sds等中的溶出 状况，结果所选介质均不能

26、理想地溶解as2s2o为了更好的 模拟体内过程，本研究选择人工胃酸作为溶出介质。参考文献1 林梅，裴军昌，张东生.雄黄抗癌作用的研究进展j中国实用医药杂志，2007,2 (13)：1.2 王梦昌，杨丽红，刘陕西，等.黄诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究及临床应用j.陕西医学杂 志，2002,31 (1)：38.3 wang h y, liu s x, lu x h, et al. geneexpression profile changes in nb4 cells induced by realgarj chin med j (engl), 2003,116 (7)：1074.4 张晨，黄世

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28、and processing method on the cytotoxicity of realgar nanoparticles in cancer cell linesj. int j nanomedicine, 2011,6：1569.8 中国药典.一部s. 2010：附录50.9 zhao w z, lu x, yuan y, et al. effect of sizeand processing method on the cytotoxicity of realgar nanoparticles in cancer cell linesj. int j nanomedicine,

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31、, shi feng, yang gang, feng nian-ping(college of pharmacy , shanghai university of traditional chinese medicine, shanghai 201203, china) abstract objective： to improve the stability and dissolution of realgar nano-particles by solid dispersion. method： using polyethylene glycol 6000 and poloxamer-188 as