实验三(设计性实验)九龙江水大肠菌群的测定

1、实验三（设计性实验）九龙江水大肠菌群的测定九龙江水大肠菌群的测定周涛（闽南师范大学生科院食品科学与工程14级）摘要：本文通过多管发酵法测定水源水大肠菌群数量，初步发酵试验 检测水源水存在大肠杆菌菌群，平板分离得到单一菌群群落，复发酵试验通过革兰氏染 色确定为大肠菌群阳性结果。关键词：九龙江水、大肠菌群、多管发酵法、初步发酵试验、平板分 离、复发酵试验、革兰氏染色、determination of coliform bacteria jiulongriver watertao zhouabstract: in this paper, multiple tube fermentation meth

2、od determinedby the number ofcoliform source water, preliminary fermentation tests detect thepresenee of e. coli bacteria source water, flat flora isolated single communit% complex fermentation test by gram stain identified as coliform positive results key words: jiulong river water, coliform, multi

3、-tube fermentation method,prelimi naryfermentation tests, flat separated, complex fermentation test, gram stain,1材料与方法1.1基本原理多管发酵法包括初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。1.1.1初步发酵试验（48h，需2天）发酵管内装有乳糖胆盐蛋白腺液体培养基，并倒置一德汉氏小导管。 乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖 而产生酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有滉甲酚紫作为 ph指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。漠甲

4、酚紫还有 抑制其它细菌如芽范菌牛长的作用。水样接种于发酵管内，37°c下培养，24h内小套管中有气泡形成，并 且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性结果，但也有 个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完 全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h后才产气，此时应 视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确 定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结果。1.1.2平板分离（1天，初发酵2天后做此实验，此实验第2天即可做 革染）平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝 琼脂（embagar），前者含

5、有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养 基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的 酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群落变成为带金属 光泽的深红色。亚硫酸钠还可以抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板 含有伊红美蓝染料，在此作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时, 该两种染料即结合复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带 核心的、有金属光泽的铜绿色深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24h内产酸产气邙日性结果）和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。1.1.3复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性芽砲杆菌者，通过 此试

6、验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的, 最后确定为大肠菌群阳性结果。1.2实验材料和设备：器材：试管、吸头（lml. 5ml）、冰箱、量筒、玻棒、烧杯、ph计、培养皿、 水浴锅（箱）、培养箱、试剂瓶、电磁炉、显微镜、锥形瓶、接种环、干 燥箱、汉德氏管、高压灭菌器、单道移液器、电子分析天平、培养基：乳 糖胆盐蛋白月东、伊红美蓝琼脂（emb）1.3操作步骤（一）多管发酵（大肠菌群的测定）1.3.1水样的采集：用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避 免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，

7、从而增加污染。1.3.2水样的稀释：将灭菌的三根试管各装9ml的无菌水标上1、2、3各组的记号。充分 振荡水样，从中吸取lml于1号试管中，充分振荡即得1： 10的稀释液。 同理配制1： 100及1000稀释液。1.3.3水源水的检查（1）从原水样、1:10、1:100、1： 1000的稀释液各吸取lml于4支经 过灭菌的装有10m乳糖胆盐蛋白陈液体培养基中，内倒置一德汉氏小导管。（每吸取一次，吸头都要换一次）。（2）将上述溶液混匀后，于36摄氏度培养24h, 24h未产气的继续 培养至48h。记录其稀释液的产气管数，进行复发酵试验。（3）平板分离经24h及48h培养后，将产酸产气的发酵管，分

8、别划线接种于相应稀 释梯度标签的伊红美蓝琼脂平板上，再于37°c下培养18-24ho（4）复发酵试验培养1824h后，将符合卞列特征（产酸产气）的菌落的一小部分，进 行涂片，革兰氏染色，镜检。经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽 抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于乳糖胆盐蛋白腺液体培养 基中，37°c培养24h,结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表， 即得大肠菌群数大肠菌群检数表（中度污染水）附录:1乳糖胆盐蛋白腺液体培养基（本实验采用合成培养基）乳糖log 蛋白腺20g0.04%澳甲酚紫水溶液25ml

9、 （配制时需加热才能溶解）胆盐5g蒸憾水1000ml将上述培养基成分溶解于1000ml蒸惚水中后（不能加热），调 ph7.27.4,加入0.04%漠甲酚紫水溶液25ml,充分混匀，分装于置有德汉 氏导管的试管内。115°c灭菌15mino 1.4革兰氏染色法1.4.1基本原理:革兰氏染色法（gram's staining method）是细菌学屮广泛使用的一 种鉴别染色法，1884年由丹麦医师gram创立。革兰氏染色法不仅用来 观察细菌的形态，而且它还是细菌鉴定的重要方法，可将所有的细菌区分 为革兰氏阳性菌（g+）和革兰氏阴性菌（g）两大类，是细菌学上最常用的鉴别 性

10、染色法。革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染 剂-碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成 分子量较大的复合物；然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保 留初染剂的颜色（紫色）者为革兰氏阳性菌g+,如被脱色后又染上复染剂的 颜色（红色）者为革兰氏阴性菌有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及 所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的 无芽胞杆菌都呈现负反应。该染色法所以能将细菌分为g+菌和g- 菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。g菌的细胞壁中 含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低

11、，故用乙 醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的 复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。g+菌细 胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽 聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。1.4.2器材：1 菌种 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h 营养琼脂斜血培养物，蜡样芽抱杆菌（b.cereus）1224h营养琼脂斜血培 养物。2染色剂：革兰氏染色液。3. 仪器及其他用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内 装香柏油和二甲苯），擦镜纸、生理盐水等。14.3操作步骤：1.43.1制

12、片（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中间加一滴蒸懈水，按无 菌操作法取菌涂片，制成很薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰23次固定（以不 烫手为宜）注意： 要用活跃牛产期的幼培养物做革兰氏染色； 涂片用的载玻片要洁净无汕污迹，否则影响涂片。 挑菌量应少些，涂片宜薄，过厚重叠的菌体则不易观察清楚。1.4.3.2 初染（1）结晶紫色染色：将玻片置于干净的培养1111上，加适量（以盖满 细菌涂面）的结晶紫染色液染色12分钟。（2）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。1.4.3.3 媒染（1）用碘液冲去残水，并用碘液覆

13、盖约1分钟。（2）水洗：用水洗去碘液。1.4.3.4 脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加 95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性细菌也 可被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。而脱色时间过短，革兰氏阴性细 菌则会被误认为是革兰氏阳性细菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄、脱 色时玻片晃动的程度等因素的影响。脱色时间一般约20-30so1.4.3.5 复染（1）用番红复染约2分钟。（2）水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。（3）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。1.4.3.6 镜检镜检时先用低倍，再用高倍，最后

14、用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。2总结与讨论注意事项：1、在初步发酵试验中，德汉室小导管倒置时，应先使液体斜面倾斜， 再迅速把小导管倒入试管内，如果动作缓慢，则进入试管内的小导管会有 气泡，影响实验结果判断。2、在平板分离试验中，手拿培养皿时注意靠近酒精灯，对接种环进 行杀菌，否则，容易引入杂菌。3、革兰氏染色中，注意初染、媒染、酒精脱色、复染的步骤顺序， 每一次染色都耍用水冲洗至水流没有颜色为止，每次染色都耍保证染色时 间1一2分钟。4、显微镜观察时，注意规范使用。问题与思考（1）你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？答：制备适宜的培养基、在超净工作台上进行