成人退变髓核细胞体外培养和细胞周期测定

1、成人退变髓核细胞体外培养和细胞周期测定:邱匀峰，吴小涛，赵梓汝，王运涛【摘要】 目的建立成人退变髓核细胞的单层培养模型并观 察其形态；测定其细胞周期，探讨传代后髓核细胞生长不佳的原 因。方法取24例椎间盘突出症患者手术切除的椎间盘组织， 分离出髓核组织，胰酶和胶原酶消化，dmem/12培养基培养。倒置 相差显微镜观察其形态学特征，流式细胞分析仪检测原代和p2细胞 周期。结果(1)原代髓核细胞生长良好，7 d后贴壁生长的细 胞可达90%o (2)原代细胞凋亡率为(38.10±11.7) %, p2代凋 亡率为(44.74±17.6) %,原代s期细胞(7.88±2.

2、1)%, p2 s期细 胞(2.76±07)%。结论传代后的髓核细胞凋亡率增高，s期细胞 减少明显。【关键词】椎间盘；髓核细胞；细胞周期；凋亡abstract: objective to establish an in vitro tensional culture model of degenerated nucleus pulposus and detect samples? cell cycle by floetry to study protruded discs of 24 patients edium. cell morphology icroscope and cell

3、 cycle of the primary and p2 cells etry after proliferation in monolayer cultureresult 1.primary culture cells of nucleus pulposus greedium, and 90% cells adhere to layer after about 7d 2.the rate of apoptosis of np: primary (38.10+ 11.7)%, p2 (44.74 ± 17.6) %. the rate of s period : primary (7

4、.88 + 2.1%), p2 (2.76 + 0.7) %. conclusion em/f12培养液的无菌培养瓶并置入冰盒内迅 速带回实验室。半小吋内在超净台内剪碎消化培养，在无菌超净工 作台中，将取出的髓核组织用pbs液冲洗3次去除血污，弃去纤维 环，将胶冻样或软骨样髓核组织剪碎成1 mmx l mmx 1 mm大小的 碎块。37°c下以0.25%(m/v)的胰蛋白酶消化20 min,每5 min,轻 轻摇动1次。800 r/min离心5min,弃去上清液。36.5°c下用0.2%的 ii型胶原酶静置消化4 h,至组织块逐渐消失。800 r/min离心5 min,去除

5、上清液;用dmem/f12培养液吹匀细胞，再次离心，重复 3次。用计数板进行细胞计数，按1x106接种于底面积为25 cm2 培养瓶中，加入5 ml含青霉素100 u/ml、链霉素100 u/ml和20% 胎牛血清(fbs)的dmem/f12培养液。3丁c、体积分数为5%co2的 培养箱中培养。每23 d换液1次，每2 d用倒置相差显微镜进行 观察、拍照。90%融合后用质量分数为0.25%的胰酶消化并按1 ：2 比例传代。1.2.2流式细胞分析细胞周期对原代髓核细胞和p2髓核细胞用流式细胞分析仪检测细胞周期及 凋亡率。各组收集1 x106个细胞，pbs洗涤，(缓慢加入3 ml 70% 冷乙醇2

6、0°c固定过初。细胞检测前，pbs洗涤，加入碘化丙噪(pi) (sigma美国)1 ml避光孵育20 min。用流式细胞仪(美国 becton dickinson, facs calibur 型)测定细胞周期，modfit 软件分 析细胞周期的分布和凋亡率。每组样本重复3次。1 3统计学方法将所得数据以均数土标准差(x土s)表示，并土对数据进行t检验 (表 1)。2结果2.1倒置相差显微镜观察髓核内有三类细胞：脊索细胞胞体较小，呈多角形，或圆形，胞浆 内含空泡，贴壁后伸出伪足；软骨或类软骨细胞，胞体较大，呈圆 形或椭圆形；成纤维样细胞，贴壁后呈梭形。2.2培养特性：原代培养的退变髓核

7、细胞的贴壁时间较长，24 h后开始有少量细胞 贴壁，3 d后半量换液，7 d后全量换液时可达90%贴壁(图1), 甚至10 d后仍有少量细胞贴壁。1520 d后髓核细胞开始进入对数 生长期，增殖、融合非常活跃，光镜下可见多处细胞克隆，并分泌 大量颗粒，有较多细胞开始融合。原代培养30 d达到90%融合可以 传代(图2),传至第5 d (p5)后的细胞体积增大，呈现圆形，或 不规则形，片状生长，细胞增殖几乎停滞，同时胞内空泡增多，出 现明显衰老迹象(图3) o图1贴壁后的髓核细胞呈多角形，圆形 和梭形数量较少图2传代前的原代髓核细胞图3p3代的髓核细胞 体积明显变大，生长变缓，形态不规则。(x2

8、00)倒置像差显微镜 观察表1原代及p2髓核细胞周期检测结果(n=24, x-±s) g0/g1sg2/m 凋亡率原代(71.46 ± 22.3)%( 7.88 ± 2.1)%(20.59 ± 5.9)%(38.10± 11.7)%p2(71.01 ± 19.7)%(2)( 2.76 ± 0.7)% (26.23土 7.2)%(44.74±17.6)%注：与原代细胞比较p<0.01有显著性 差异；与原代细胞比较p>0.053讨论髓核细胞的体外培养相对困难，对培养的条件要求较高，培养时间 较长。helen

9、等2认为即使给予较高的营养条件，椎间盘细胞生 长也相当缓慢，细胞约需1个月吋间才能从最初的组织块长至p1。 ichimura 3等发现，髓核细胞的培养中最适宜ph值为7. 0。ph 值降低可引起细胞代谢障碍，甚至导致细胞死亡，细胞内ph值降 低也是细胞凋亡的一个重要特征。刘勇等4观察发现ph7.07.4 之间髓核细胞生存活力未见明显差异性。chiba 5采用 dmem/f12对兔椎间盘组织块进行培养时发现，组织块形态良好， 组织块内细胞代谢活跃。本实验采用dmem/f12培养基加体积分数 为0.20胎牛血清，培养基ph控制在ph7.07.4之间用于髓核细胞 培养，细胞生长良好，并能增殖传代。人

10、退变椎间盘细胞的贴壁时 间为57d甚至更长，其稳定生长期较长，对数生长期短，细胞生 长周期较长，说明退变的椎间盘细胞的生长活力低下。传代后髓核 细胞生长相对较快，约30 d可以传1代，但当传至第2代时其细胞 内空泡增多，分泌颗粒增多，细胞开始呈现衰老迹象。传到第5代 后，细胞生长明显停滞。既往的研究6证明，在退变腰椎间盘中，髓核细胞凋亡率可高 达.3±24.5)%,和本实验的结果相符。本实验中细胞经过12次 传代后，髓核细胞体积明显变大，细胞周期测定显示71%细胞停滞 在g0/g1期，传代对其影响不明显。张传志等7观察到即使在 最佳营养条件下，体外培养髓核细胞经过多次传代后逐渐死亡，

11、推 测和细胞牛长周期有关。发现体外培养的退变髓核细胞s期细胞较 少，s期是细胞分裂的关键期，在此期间细胞的dna含量通过复制 而加倍，传到p2后该期细胞降低明显(p&lt;0.01),而传代后髓核 凋亡率升高(p&lt;0.01) o这可能和s期细胞合成活跃对胞内外环 境要求较高有关，外界环境(如胰酶的反复作用等)的变更作用诱 使这类细胞发生凋亡。推测如果能针对这一特点加以干预，可能会 使细胞增殖加速，而且最佳干预吋期应在p1甚至原代。takuji等8发现周期性机械张力可促使髓核细胞增殖，主要表现在s期细 胞的合成增加，髓核细胞的dna合成增加。gruber等9采集椎 间盘细胞

12、进行体外单层培养，并在培养液中加入不同浓度的igf-1 和pdgf,发现这两种生长因子均可降低椎间盘细胞的凋亡率，并 且抑制效应与生长因子的浓度相关。yamamoto等10将兔髓核细 胞和间充质干细胞共同培养后发现，与间充质干细胞直接接触后髓 核细胞增殖加快、活力上调。髓核细胞体外培养模型的建立和细胞 周期的检测为进一步体外扩增髓核细胞提供了实验基础和依据。3结论通过本次实验观察，笔者认为传代后髓核体外培养中有s期细胞减 少，凋亡率高的现象，因此在培养过程中除了要注意培养液ph 值、胎牛血清浓度等一般营养条件外，应着重注意防止在传代中诱 导或加剧细胞凋亡的因素。例如传代时选用低浓度的胰酶，适当

13、减 少消化时间；从原代培养开始适当在培养液中添加igf-1等抑制凋 亡的生长因子也是很简便的方法。【参考文献】1 an hs , thonar ej , masuda k.biological repair ofinterverteral disc j .spine, 2003, 1:86-92.2 gruber he, fisher ec jr, desai b, et al.human ivtervertebral discs from the annulus:three-dimensional culture in agarose or alginate and responsivene

14、ss to tgf- p 1 j .exp cell res, 1997, 235:13-21.3 ichimura k, tsuji h , matsui h , et al.cell culture of the intervertebral disc of rats , factors influencing culture , proteoglycan , colleagen , and deoxyribonucleice acid synthesisj .spinal disord, 1991, 4:428-436.4 刘勇，胡有谷，陈晓亮腰椎间盘细胞的培养及形态学观察 j 中华医学

15、杂志,1999 , 79:101-109.5 chiba k, andersson gb, masuda k, et al. a ne to study the metabolism of the intervertebral disc in vitro j .spine, 1998, 23:1821-1828.6 kohyama k, saura r, doita m, et al.intervertebral disc cells apoptosis by nitic oxide:biological understanding of intervertebral disc degeneration j med sci, 2000, 46:283-295.7 张传志，周跃，李长青兔髓核细胞体外最佳培养营养条件的 探索j中国 矫形外科杂志，2005, 13： 1093-1094.8 matsumoto t, kai m, kuribayashi k, et al.cyclic mechan