葫芦科植物未授粉子房培育单倍体探究进展

1、葫芦科植物未授粉子房培育单倍体探究进摘要：综述了近年来葫芦科植物未授粉子房培养单倍 体状况，及葫芦科植物未授粉子房培养的取材、基因型、温 度、激素等几个因素影响的研究进展，进而对其当前问题及 前景进行了探讨。关键词：葫芦科；未授粉子房；单倍体染色体加倍能快速纯化单倍体植株育种材料，缩短育种 年限，且使单倍体材料能在当代即表现出显隐性基因型性 状，在育种方面发挥着重要作用，在遗传学研究及基因图谱 构建等方面也具有重要的意义。葫芦科(cucurbitaceae) 植物分布在中国的有130多个种，其中甜瓜、黄瓜、南瓜、 葫芦、西瓜等都具有很髙的经济价值，其品种改良具有极大 潜力。在自然界中葫芦科植物

2、自发产生单倍体的频率极低1 ,而长期的研究结果表明，通过花药和小胞子培养在葫 芦科植物中得到单倍体的几率很小，但通过葫芦科植物雌核 发育(gynogenesis)途径进行单倍体研究是一条重要途径。 雌核发育是指离体条件下由未授粉胚囊产生单倍体胚和植 株的过程2。雌核发育培育单倍体主要有2种方式：一种 是让精子入卵后，保证精核不与卵核融合而退化，刺激卵核 分裂发育为胚，这种方式主要通过辐射处理花粉授粉后将雌 核离体培养；另一种是对未授粉子房或胚珠进行离体培养， 诱导雌核发育。本文着重对未授粉子房培养研究状况及影响 因素作出简要概述。1葫芦科植物雌花未授粉胚珠离体培养单倍体研究概未授粉胚珠离体培养

3、是一种简单有效的加速植物快速 纯化的方法，而且为研究孤雌生殖或无配子生殖的细胞胚胎 学提供稳定的实验体系。1985年，chamboner等3首次在西葫芦中采用未授粉 胚珠离体培养技术获得单倍体和二倍体的植株ometwally等 4, 5对西葫芦品种eskandarani 花前1 d的雌花，通过 低温诱导和含不同浓度2, 4-d的ms培养基进行培养，成功 获得了西葫芦单倍体植株。随后国内学者陈学军等6、谢 冰等7分别在西葫芦中得到胚囊植株并驯化成功。刘栓桃 等8利用9个不同基因型的西葫芦材料，研究了激素、取 样时间和基因型3个因素对西葫芦未授粉胚珠离体培养的影 响。南瓜子房未授粉子房培养试验19

4、88年获得初始成功9。 shalaby 10在 metwally 等4的基础上采用 1 mg/l 2, 4_d 和kinetin培养基对基因型、雌花位置、温度和蔗糖浓度4 个因素进行研究并获得了南瓜单倍体植株。黄瓜的未授粉子房离体培养研究始于1996年，但起始效果不佳lljogemes等12将黄瓜子房放置于诱导培养基 上，在不同温度下热激并暗处理25 d,随后转移到再生培 养基进行培养。结果表明，热激处理通过优化雌配偶体发育 提高雌核再生频率。并通过组织观察发现雌性配子体的单倍 体诱导的最佳时期为胚囊形成阶段。国内随后也对黄瓜基因 型、取样时期、激素及处理温度对胚状体的诱导进行了探讨 1316

5、,并获得了纯合的黄瓜材料。ficcadenti等17首次在甜瓜中采用未授粉胚珠离体 培养技术，其选择了 2个常规材料和1个f1代杂交种进行 培养并获得再生胚。随后lotfi等18也对甜瓜进行了未授 粉胚珠离体培养。malik等19对不同温度和几种不同激素 对甜瓜未授粉子房培养效果进行研究，采用ssr分析证实获 得的双单倍体植株为纯合双单倍体，并通过ssr标记证实这 些获得的双单倍体为纯合的雌配子的再生胚。以上这些研究结果表明，未授粉子房培养技术在葫芦科 植物育种及科学研究中的重要地位受到越来越多研究者的 重视。而其复杂的影响因素对建立高效稳定的技术体系有着 严重阻碍，因此探讨其最佳的培养条件对

6、该项技术的应用有 着重要意义。以下对其影响因素相关研究进展进行概述。2未授粉葫芦科植物胚胎发生影响因素2. 1取材状况许多研究结果表明，试验材料的播种时期、雌花的发育 时期及雌花的部位等对胚胎离体培养中的胚诱导频率都有 着重要的影响。陈学军等6通过对西葫芦开花前3d,当日 和开花后2d未授粉子房分别进行培养，结果显示诱导率分 别为10.5%, 14.2%和4. 4%,表明开花当日子房离体培养效 率最高。谢冰等7通过西葫芦不同开花时期取材试验证实 开花前1 d和开花当日胚珠诱导频率最高，秋播材料诱导频 率较夏播和春播的高。shalabyelo对2个南瓜giad和raad 的f1代的第一节雌花、第

7、二节雌花和第三节雌花分别进行 未授粉胚珠离体培养研究后发现，第二节雌花胚诱导和成苗 效果最佳。刘栓桃等8对9种基因型西葫芦材料进行不同 开花时期取材试验，结果显示，除1个材料没能得到再生植 株外，其他均表现为开花当天的胚珠最适合诱导培养，再生 植株产率表现最高。2.2基因型ficcadenti 等17对 2 个甜瓜品种(reticulatus, inodorus)及其杂交种进行了未授粉雌花子房培养，结果显 示，reticulatus出胚率最高。shalaby10对12种不同基 因型南瓜品种的未授粉雌花子房培养发现，raad fl代材料 表现最佳，胚诱导率为48. 4%,每皿成苗15株。刘栓桃等

8、8 对9个不同基因型西葫芦材料的未授粉胚珠诱导培养发现， 再生植株产率最高的能达到33. 33%,而最低的仅为2. 67%o 陈小鹏等14对3个黄瓜品种未授粉子房的胚状体诱导试验 结果表明，黄瓜基因型对雌核发育也有着重要影响。以上这 些结果表明，基因型在甜瓜、南瓜、西葫芦等葫芦科植物的 雌核发育中有着重要作用。2.3温度预处理温度处理极有可能促进雌核发育由正常配子发育 (gametophytic development ) 转换成腐生途径 (saprophytic pathway),从而导致单倍体胚形成10。kwack等9研究表明，南瓜在51条件下预处理2 d能提高 胚胎的发生几率o g e

9、mes等12将黄瓜子房放置于诱导培养 基(induetion media containing thidiazuron)上，分别 在24, 28, 35£环境下暗处理25 d；随后转移到再生培 养基 (rege nera tio n media a -naphthaleneace ti c acid a nd 6-benzylaminopurine),结果表明，热激处理通过优化雌配 偶体发育提高雌核再生频率。其中35*胚胎再生效果最好，其胚胎发生频率为18.4%,植株再生频率为7. 1%o shalaby 10将南瓜queen fl代分别放置在4°c和32°c下

10、预处理0, 4, 7, 12 d,结果显示，4°c或32°c条件下都是4 d的处理效果最佳。diao等16对黄瓜的研究结果也 表明，在35"条件下热激3 d的效果较2 d和4 d的好。此外在对葫芦科植物子房进行温度刺激预处理的试验 中，也有些结果表明，热激或冷激处理对雌核诱导成单倍体 有副作用。yang等20的研究结果表明，许多物种中冷激 处理对雌核培养具有副作用。metwally等4通过将开花前 1 d的西葫芦(eskandarani)在4°c分别进行2, 4, 8 d预 处理，结果发现不进行预处理的的材料具有最高的胚诱导率。2.4激素处理kwack等

11、9研究认为，植物激素对南瓜的胚发生有着 重要作用。metwally等4在诱导西葫芦未授粉胚胎分化时 分别使用浓度为0.1, 1, 5, 10 mg/l的2, 4-d,结果发现 1 mg/l和5 mg/l 2, 4-d处理的胚诱导率较高。malik等19在进行甜瓜未授粉子房培养时发现，0.04 mg/l和0.02 mg/l的tdz在诱导培养基中显著增加胚珠愈伤产生，胚诱导 率分别为46. 6%和65. 83%,而浓度为0. 6 mg/l的6-ba激素 显著提高外植体再生率。diao等16认为，tdz能促进胚胎形成，以0. 04 mg/l的tdz效果最佳。而将agn03加到诱导培养 基中对胚的诱导

12、并没有显著影响，但会缩短胚胎萌芽期和提 高胚胎形成数目，其选用的材料之间出胚率并无显著差异。 谢冰等7将西葫芦未授粉胚珠接种至含不同浓度2, 4-d, naa, ba 的 n6 培养基上，结果发现，2 mg/l 2, 4-d+0. 5 mg/l naa+1 mg/l ba培养基上的胚状体诱导频率最高。刘栓桃等8通过对4个西葫芦品种研究结果表明，在浓度为0. 5 mg/l naa和1. 0 mg/l的2, 4-d的培养基上再生植株产率最高，达 28. 33%o2.5琼脂和蔗糖浓度陈学军等6发现，西葫芦胚珠愈伤组织诱导成苗阶段, 蔗糖浓度为20 g/l的培养基上芽诱导率最高，为15. 6%o sh

13、alaby 10在南瓜eskandrani胚珠诱导时使用30, 60, 90 g/l的蔗糖浓度梯度比较发现，蔗糖浓度为30 g/l时，胚珠 诱导效率最佳，而蔗糖浓度为90 g/l时，胚珠完全不能生 长。这些结果表明，在愈伤组织芽分化时可能需要较低的渗 透压。此外，agn03是乙烯合成的抑制剂，mohiuddin等21 认为，agn03影响愈伤组织的内源激素代谢从而有利于葫芦 科植物植株的再生。陈学军等6研究发现n03-有利于不定 根的形成。韩丽华等22将甜瓜胚珠用不同浓度的硝酸银进 行处理，结果显示在硝酸银浓度为80 mg/l时出胚率最高， 为 0. 74%o3未授粉子房培养展望葫芦科植物具有

14、很高的经济价值，通过单倍体离体诱导 技术对葫芦科植物的品质、抗逆性、抗病害能力等进行改良, 将会在葫芦科植物的遗传育种中开拓一条崭新的途径。自从 20世纪60年代利用未授粉子房培养单倍体获得成功以来 23,自然界植物的单倍体育种技术也取得长足的进步。通 过未授粉子房培养单倍体的技术快速纯化葫芦科植物基因 型，加快育种进度在葫芦科植物育种中具有重要意义。当前 通过未授粉子房培养单倍体的方式在育种中已经取得了一 些进步，但是当前葫芦科植物未授粉胚珠离体培养的过程中 仍存在许多复杂的影响因素导致其诱导率、成胚率、成苗率 较低等。因此通过改进实验技术来提高诱导效率，建立稳定 性好，重复性高的未授粉子房

15、离体培养技术在葫芦科植物育 种中具有重要意义。参考文献1 savin f, decomble v, le couviour m, et al.the x-ray detection of haploid embryos arisen in muskmelon cucumis melo l. seeds, and resulting from a parthenogenetic development induced by irradiated， pollenj. cucurbit genetic cooperative report, 1988, 11：39-42.2 san noeum l

16、h. in vitro induetion of gynogensis in higher plantsm wageniegen： proceedings of the conference on broadening gene tic base of crops, 1979： 327-329.3 chambonner d, dumas de vaulx r. obtention ofembryos and plants from in vitro culture of unfertilizered ovules of cucurbita pepoj cucurbit genet coop r

17、pt,1986,8：66.4 metwally e i, moustafa s a, ei-sawy b i, er al. production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of cucurbita pepoj plant cell, tiss org cult, 1998,53：117-121.5metwally ei, moustafa s a, ei-sawy bi, et al. haploid plantlets derived by anther culture of cucurbi

18、ta pepo j. plant cell, tiss org cult, 1998, 52： 171-176.6 陈学军，邢国明，陈竹君西葫芦未授粉胚珠离体 培养和植株再生j浙江农业学报,2000, 12 (3)： 165-167.7 谢冰，王秀峰，樊治成西葫芦未受精胚珠离体培 养条件的优化及胚囊植株的产生j.中国农业科学，2000, 39 (1)： 132-138.8 刘栓桃，赵智中，孙小镭，等西葫芦未受精胚珠 离体诱导植株再生的关键因素j.华北农学报，2008, 23(2)： 96-100.9 kwack s n, fujieda k. somatic embryogenesisin c

19、ultured unfertilized ovules of cucurbita moschataj. j jpn soc hort sc, 1988,57：34-42.10 shalaby t a. factors affecting haploid induction through in vitro gynogenesis in summer squash (cucurbita pepo l. )j scientia horticulturae,2007,115(1)：1-6.11 g e mes juh a sz a , venczel g, balogh phaploid pla.n

20、t induetion in zucchini (cucurbita pepo l. convar giromontiina duch) and in cucumber (cucumis sativus l. ) lines through in vitro gynogenesisj acta hortic, 1996,447:623-625.12 g e mes juh a sz a, balogh p, ferenczy a, etal. effect of optimal stage of female gametophyte and heat treatment on in vitro

21、 gynogenesis induction in cucumber (cucumis sativus l. ) j plant cell rep, 2002,21 (2)：105-111.13 杜胜利，韩毅科，魏爱民，等.黄瓜倍性鉴定方法 的研究j园艺学报，2002 (29)： 280-281.14 陈小鹏，刘栓桃，孙小镭，等.黄瓜未授粉子房的 胚状体诱导研究初报j西北农业学报，2006, 14 (2)： 148-151.15 韩毅科，杜胜利，魏爱民，等.利用未受精子房培 养技术育成黄瓜新品种'津美3号'j.园艺学报，2010, 37 (3)： 509-510.16 diao

22、 w, jia y, song h, et a 1. efficient embryoinduction in cucumber ovary culture and homozygous identification of the regenetants using ssr markers j scientia horticulturae, 2009,119：246-251.17 ficcadenti n, sestili s, annibali s, et al. in vitro gynogenesis to induce haploid plants in melon(cucumis m

23、elo l. )j journal of genetics andbreeding, 1999,53 (3)：255-25718 lotfi m, alan a r, henning m j, et al. production of haploid and doubled haploid plants of melon (cucumis melo l ) for use in breeding for multiple virus resistance j plant cell rep, 2003, 21 (11)： 1 121-1 128.19 malik a a, cui l, zhan

24、g s, et al. efficiencyof ssr makers for determining the origin of melon plantlets derived through unfertilized ovary culturej hort sci,2011,38 (1)：2734.20 yang hy and zhou c. in vitro induction ofhaploid plants from unpollinated ovaries and ovulesj theor appl genet, 1982,63：97-104.21 mohiuddin a k m, choedhury m k u, abdullahz c, et al. influence of silver nitrate (ethylene inhibitor) on cucumber in vitro shoot regenerat ion j. plant cell, tissue and organ culture ,1997,51：75-78.22 韩丽华，王建设，陈贵林.agn03对甜瓜离体胚囊 的影响j河北农业大学学报,2005, 28 (2)： 48-