DNA拓扑异构酶概述

1、dnadna 拓扑异构酶综述拓扑异构酶综述摘要摘要： dna 拓扑异构酶为催化dna 拓扑学异构体相互转变的酶之总称，是一种见于真核细胞和原核细胞中的重要生物酶， 其对 dna 转录、复制、 染色体分离及基因表达等过程中的 dna 拓扑结构起着重要的调控作用。研究发现， 与正常细胞不同，dna 拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达， 而许多抗肿瘤药物的作用机制也与 dna 拓扑异构酶密切相关， 因此它作为抗肿瘤药物的重要靶点引起了研究者的广泛关注。此外，科学家们还发现拓扑异构酶在神经发育调节上也起着一定的作用， 虽然机制还需要进一步研究， 但这一发现就有着重要意义。本文对d

2、na 拓扑异构酶的反应、结构、分类及生物功能进行了简要的归纳， 介绍了 dna 拓扑异构酶抑制剂的研究及分类，并对拓扑异构酶在其他方面上的进展进行了简单的介绍。关键词关键词：dna 拓扑异构酶拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤药物生物功能dna 拓扑异构酶（topoisomerase）调控 dna 超螺旋状态，它是存在于细胞核内的一类酶，参与dna 复制、重组、转录、修复等核内关键作用，它们能够催化 dna 链的断裂和结合，从而影响 dna 的拓扑状态。 真核细胞的拓扑结构由两种关键拓扑异构酶拓扑异构酶i 和拓扑异构酶ii调节， 拓扑异构酶i通过形成短暂的单链裂解-结合循环，催化 dna 复制的拓扑异构状

3、态的变化；相反，拓扑异构酶 ii 通过引起瞬间双链酶桥的断裂， 然后打通和再封闭， 以改变 dna 的拓扑状态。哺乳动物中，拓扑异构酶 ii 又可以分为ii 型和ii 型。拓扑异构酶的应用也很广泛，如现已知这些酶是很多抗肿瘤药物的细胞内靶酶，在肿瘤细胞中，拓扑异构酶的含量高于正常细胞，所以以其为靶点的抑制具有一定特异性，因此对它的研究也越来越重视。1 1、dnadna 拓扑异构酶拓扑异构酶 i i拓扑异构酶 i 催化 dna 链的断裂和重新连接， 每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如atp或 nad。拓扑异构酶i 又称蛋白，大白鼠肝dna 拓扑异构酶 i 又

4、称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。dna 拓扑异构酶能催化的反应很多，如dna 拓扑异构酶 i 对单链dna 的亲和力要比双链高得多，这正是它识别负超螺旋dna 的分子基础，因为负超螺旋 dna 常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，dna 拓扑异构酶 i 作用越快。现已知道，生物体内负超螺旋稳定在 5%左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶 i 和 ii 的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码ecoli 拓扑异构酶 i 的基因 topa 发生突变，则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，细胞生活能力降低。拓扑异构酶i 作

5、用的碱基序列特异性不高，但切点一定在 c 的下游方向 4 个碱基(包括 c本身)的位置。在将 dna 单链切断后，拓扑异构酶 i 连接于切口的 5端，并贮藏了水解磷酸二脂键的能量用以连接切口， 因而拓扑异构酶i 的作用不需能量供应。此外拓扑异构酶i 还能促进两个单链环的复性，其作用是解除复性过程所产生的链环数的负值压力， 以使复性过程进行到底。如果在一个单链环上一个部位切断， 而使另一部位绕过切口则可产生三叶形结构分子 (trefoil knot)。如果有两个双链环，其中一个有一个切刻，拓扑异构酶 i 则可以将切刻对面的一条链切断，使完整的双链环套进去，再连接起来而成为环连体分子(catena

6、ne)。拓扑异构酶最早是 1971 年在大肠杆菌中被发现的，均为单体酶。拓扑异构酶根据其结构域功能可以划分为 4 个域:c 端结构域(c terminal domain) 、核心结构域 (core domain)、连接子区域(linker domain)和 n 端域(n-terminal domain)，其中 c 端结构域、核心结构域在催化活性中起主要作用。 在拓扑异构酶的多个活性位点中，arg488、arg590、his632 和 tyr723 为研究比较明确的 4 个活性位点7，8。除 tyr723 位于羧基端结构域外，其余三个均位于拓扑异构酶的核心结构域，如下图所示。（左 a：topo晶

7、体结构；右 b：topo活性位点）2 2、dnadna 拓扑异构酶拓扑异构酶 iiii拓扑异构酶 ii 能同时断裂并连接双股 dna 链 它们通常需要能量辅因子 atp。在拓扑异构酶 ii 中又可以分为两个亚类：一个亚类是dna 旋转酶(dna gyrase )，其主要功能为引入负超螺旋，在 dna 复制中起十分重要的作用。迄今为止，只有在原核生物中才发现 dna 旋转酶，另一个亚类是转变超螺旋dna(包括正超螺旋和负超螺旋)成为没有超螺旋的松弛形式(relaxed form )。这一反应虽然是热力学上有利的方向，但不知道为什么它们仍然像dna 旋转酶一样需要 atp，这可能与恢复酶的构象有关

8、。 这一类酶在原核生物和真核生物中都有发现。大肠杆菌的拓扑异构酶 ii 除了引入负超螺旋以外 还具有形成或拆开双链 dna 环连体和成结分子的能力。ii 类拓扑异构酶没有碱基序列特异性，它们可以和任何相交的两对双链dna 结合。dna 旋转酶有两个亚基和两个亚基。亚基约105kd，为 gyra 基因所编码，具有磷酸二脂酶活性，可为萘啶酮酸(nalidixic acid )所抑制。亚基约 95kd，为 grab 基因所编码，具有atp 酶活性，可为新生霉素(novobiocin )所抑制。这两种药物均可抑制野生型大肠杆菌的 dna复制。可见dna 旋转酶为 ecoli 的复制所不可缺少的。在切断

9、一条dna 双链后，两个 a 亚基各结合于切口的一个 5端，并贮藏了水解磷酸二酯键而获得的能量，由于该酶的整体性，因而 dna 链的四个断头并无任意旋转的可能性。 由于酶的别构效应， 使完整的双链穿过切口，然后再重新形成磷酸二酯键。 亚基的功能在于水解 atp 以使酶分子恢复原来的构象，以便进行下一轮反应。这一点可以用 atp 的同系物,-亚氨基 atp 代替 atp 而得到证实。因为这一同系物不能被dna旋转酶所水解， 但它确能促进第一轮拓扑异构反应， 使负超螺旋增加，而妨碍以后进一步的拓扑异构反应。真核生物拓扑异构酶为同源二聚体，包括的两个亚型拓扑异构酶和拓扑异构酶 分别定位于染色体 17

10、q2122 10 和 3p2411单拷贝基因编码的二聚体蛋白。 拓扑异构酶可划分为三个不同区域:c 端域、n 端域(atp 结合域)以及中部功能域（如下图右）。dna 拓扑异构酶的 c 端域在其对 dna 的构象识别方面起主要作用，n端域和中部功能域则为拓扑异构酶的主要活性域，如下图所示。（左上 a： topo结构； 右上 b：topo活性域）3 3、应用（应用（dnadna 拓扑异构酶抑制剂拓扑异构酶抑制剂-抗肿瘤药物的研究）抗肿瘤药物的研究）作用原理作用原理对于 dna 拓扑异构酶抑制剂的作用原理，我们可以通过影响拓扑异构酶作用过程的各个阶段来破坏酶的活性。既可以直接作用于dna，也可以作

11、用于拓扑异构酶，还可以作用于dna 拓扑异构酶-dna断裂复合物， 来完成对拓扑异构酶活性的抑制， 并最终导致细胞凋亡。抑制剂的作用实际上是使细胞内功能正常的拓扑异构酶转变为导致dna 链断裂的致伤物， 而细胞死亡的最终原因可能是由于 dna 链断裂的错误修复或是由于可断裂复合物的形成及稳定存在， 激活了细胞内一系列导致细胞程序性死亡的过程。大体上来说，dna 拓扑异构酶抑制剂的抑制机理可以分为两种，一种是毒性机理，一种是催化抑制机理。毒性机理是指抑制剂与topo-dna 共价复合物形成三元复合物，通过提高 topo-dna 共价复合物的稳态浓度使拓扑异构酶“中毒”。而催化机理是指抑制剂通过阻

12、滞拓扑异构酶的某一特定功能或催化反应中的某一步骤， 进而抑制拓扑异构酶总的催化活性。抑制剂类型抑制剂类型而对于拓扑异构酶抑制剂的类型，常用的有：有机小分子作为dna 拓扑异构酶抑制剂，因其作用的底物不同，可以分为 topo抑制剂、topo抑制剂和 topo/双重抑制剂，而以 topo为靶点的抑制剂主要是喜树碱及其衍生物；以topo为靶点的抑制剂则较多，根据与底物的作用方式不同，将拓扑异构酶抑制剂分为 topo毒剂和 topo催化抑制剂，但迄今发现的topo抑制剂大部分为 topo毒剂，常见的有阿霉素( doxorubicin) ，vp-16( etoposide) ，沙尔威辛等；大部分 top

13、o/topo双重抑制剂是 topo和 topo的双重毒剂，能同时稳定两种拓扑酶与 dna 形成的可断裂复合物，从而抑制拓扑酶的活性。还有金属配合物作为 dna 拓扑异构酶抑制剂，与有机化合物相比，金属配合物分子结构具有更好的可塑性， 容易在配体上引入其他分子活性基团，可以针对不同的底物结合环境进行相应的结构修饰;而且其丰富的光电磁性质将有助于探索某些复杂的生命过程。然而，虽然发现不少金属配合物具有识别和断裂 dna 功能，但真正在 dna拓扑异构酶抑制方面的具体应用还非常少， 至今仅有为数不多的关于金属配合物抑制 dna 拓扑异构酶的研究报道， 主要集中在铂类、 钌类、金类等金属配合物方面。其

14、次便是一些铂类配合物作为拓扑异构酶抑制剂， 铂类配合物作为研究最早的抗肿瘤药物，一直备受研究者关注。钌类配合物作为拓扑异构酶抑制剂， 钌多吡啶配合物具有既为刚性又带手性的八面体构型，水溶性比较好，热力学性质稳定，不易发生配体取代，易于在近生理条件下开展研究，光化学、光物理信息丰富，毒性低，细胞膜透性较好，但目前钌类配合物作为拓扑异构酶抑制剂的抗肿瘤， 活性研究仅限于体外研究阶段， 需要更进一步对其作用机理等进行详细的研究，以确定其作为抗肿瘤药物的临床可能性。当然，还有其他一些金属配合物作为拓扑异构酶抑制剂，除了铂、钌类金属配合物以外，常见的已用于抗肿瘤药物研究的还有金、镉、钴、镍等金属配合物，

15、但是关于它们作为拓扑异构酶的抑制剂的报道则很少。4 4、展望、展望从 20 世纪 70 年代发现 dna 拓扑异构酶晶体结构至今， 经过几十年的努力，人们已经研制出一系列的拓扑异构酶抑制剂作为有效的抗肿瘤药物应用于临床，并对其作用机理做了大量研究。 随着肿瘤生物学及相关学科的发展， 人们逐渐认识到细胞癌变的本质是细胞信号转导通路的失调导致的细胞无限增殖。 研发的重点正在从传统的细胞毒药物转移到针对肿瘤细胞内异常信号系统靶点的特异性新一代抗肿瘤药物。而 dna 拓扑异构酶作为抗肿瘤药物设计的重要靶标， 便受到了许多研究者的关注。近年来以拓扑异构酶为靶点的抗癌药物如阿霉素、表阿霉素、vp16、vm

16、26、喜树碱及其衍生物等，已成为临床化疗方案中的重要药物。但目前仍有许多问题尚待深入研究和探讨，比如多数拓扑异构酶有机抑制剂存在结构复杂、 特异性不高、溶解性差、毒性较大等缺点; 有关各类抑制剂与拓扑异构酶或（和） dna 的作用机制尚不明确; 拓扑异构酶的某些生理功能还不是太确切 ; 拓扑异构酶引起细胞凋亡过程中相关信号分子的作用、 信号转导途径的调控机制及 topo 抑制剂与信号网络的特异性等，抑制所完成的仅是全部过程中的一个必要起始步骤。所以，我们仍需更深一步的研究。5 5、其他发现其他发现不久之前，科学家发现，拓扑异构酶对“泛自闭症”有着一定的影响，研究称，一组被称为拓扑异构酶的酶系出现问题会对大脑发育的遗传机制产生重大影响，并可能导致自闭症谱系障碍（ asd） 。选择性降低拓扑异构酶活性，会通过影响“转录伸长”降低“长基因”在小鼠和人类神经元中的表达。 虽然很多 asd 候选基因特别长，但已证实几种 asd 候选基因的表达会被拓扑异构酶的抑制降低。 这些发现表明，影响拓扑异构酶的化学物质和基因突变 （也包括转录机构的其他部分）可能有