生物化学和分子生物学3

1、 重组重组dna技术技术 生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因： （1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。 生物技术将是未来经济发展的新动力第一次技术革命 工业革命解放人的双手第二次技术革命 信息技术扩展人的大脑第三次技术革命 生物技术改造生命本身 基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术 直接相关联的学科

2、：分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、生物信息学、化学工程学、医药学等。 对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术l 生物技术的主要内容 基因工程亦称遗传工程，即利用基因工程亦称遗传工程，即利用dna重组技术的方重组技术的方法，把法，把dna作为组件，在细胞外将一种外源作为组件，在细胞外将一种外源dna（目的（目的基因）和载体基因）和载体dna重新组合连接（重组），最后将重组重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因体转入宿主细胞，使外源基因dna在宿主细胞中，随细在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（胞的

3、繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。技术的诞生。伯格因此获得了。 基因工程的应用 重组dna操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）克隆:目的基因与载体连接，形成重组的dna分子；（3）转化：用重组dna分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）筛选：对转化子筛选和鉴定；（5）大量培养：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。dna重组的基本模式获得需要的目的基因常用的方法：（1 1）化学合成）化学合成（2 2）基因

4、组文库）基因组文库(genomic dna library)(genomic dna library)（3 3）cdnacdna文库文库（4 4）聚合酶链式反应（）聚合酶链式反应（pcrpcr）根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 多肽链的氨基酸顺序mrna的碱基排列顺序相应的基因结构化学合成目的基因化学合成的不足之处在于：（）要已知基因的核苷酸顺序；（）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为

5、每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（）价格昂贵。 化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。基因组文库基因组文库细胞内总dna的提取分离与基因组文库的构建 基因组基因组dnadna：在真核生物体，基因组是指：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体一套完整单倍体dnadna（染色体（染色体dnadna）和线粒体）和线粒体dnadna的全部序列。的全部序列。基因组文库 基因组文库是含有某种生物全部基因片断的基因组文库是含有某种生物全部基因片断的dnadna克克隆群体。直接从生物体中提取总隆群体。直接从生物体中提取总dnadna，用超声或酶，用超

6、声或酶处理，将染色体处理，将染色体dnadna切割成片断，插入载体，转入切割成片断，插入载体，转入受体菌扩增，得到基因组受体菌扩增，得到基因组dnadna文库，从中调用目的文库，从中调用目的基因；基因； 缺点缺点: : 结构基因只含基因组很小一部分，有重复结构基因只含基因组很小一部分，有重复序列，假基因。真核生物基因组有内含子。这些序列，假基因。真核生物基因组有内含子。这些给从基因组克隆目的基因带来困难。给从基因组克隆目的基因带来困难。 细胞内总dna的提取分离程序苯 酚 沉淀 蛋 白质乙 醇 浓缩dna组织或细胞染色体组织或细胞染色体dnadna基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组dna

7、dna分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌将总将总dnadna经过酶解，经蔗糖梯度经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的同长短的dnadna片段。包含的基因片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。生物的基因组文库。基因组基因组dnadna文库文库cdnacdna文库文库cdnacdna文库的构建文库的构建mrna 反转录酶cdna(互补dna） dna聚合酶第二

8、条dna链以以mrnamrna为模板，用为模板，用反转录酶，合成与反转录酶，合成与mrnamrna互补的互补的cdna(complementacdna(complementary dna, cdna) ry dna, cdna) 片片段，插入载体，转段，插入载体，转入受体菌扩增，得入受体菌扩增，得到到cdnacdna文库；文库；n 比较基因组文库与cdna文库 构建基因组文库获取目的基因存在的问题费时费事内含子序列 反转录人工合成互补dna方法的优势 不含内含子序列获取的dna片段往往是具有特定功能的目的基因 将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术 pcr(polymerasechainre

9、action)-聚合酶链式反应 分子生物学，医学，考古，法医 美国mullis教授1988年发明了pcr技术 1993年获得诺贝尔奖（polymerase chain reaction,pcr）（polymerase chain reaction,pcr）polymerase chain reaction质粒载体的一般结构质粒载体的一般结构dna重组的基本模式切（割目的基因和载体）载体和目的基因的切断载体和目的基因的切断 通常采用限制性核酸内切酶通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载，简称限制酶，分别对载体体dna和目的基因进行切断，

10、以便于重组。和目的基因进行切断，以便于重组。 限制酶目前已经发现限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺多种，所识别的顺序往往为序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突突出粘性末端和出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。突出粘性末端三种情况。形成粘性末端形成粘性末端(cohesive end)者较有利于者较有利于载体载体dna和目的基因的重组。和目的基因的重组。dna重组的基本模式切（割目的基因和载体）接接-载体和目的基因的载体和目的基因的连接连接 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接即将带有切口

11、的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的起来，得到重新组合后的dna分子。分子。（一）粘性末端连接法：（一）粘性末端连接法： 当载体当载体dna和目的基因均用同一种限制酶进行和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入性末端进行互补粘合，再加入dna连接酶，即连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。接。载体d

12、na与目的基因的连接（二）人工接尾法：（二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的体或目的基因的3-端，如载体上添加一段端，如载体上添加一段polyg，则，则可在目的基因上添加一段可在目的基因上添加一段polyc，故

13、二者即可通过碱，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由基互补进行粘合，再由dna连接酶连接。连接酶连接。 （三）人工接头连接法：（三）人工接头连接法： 将人工连接器（将人工连接器（linker,即一段人工合成的含有多种限即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子制酶切点的小分子dna片段片段,约约1020个核苷酸，个核苷酸， ）连接到平末端连接到平末端dna分子分子(载体和目的基因载体和目的基因)上，即有可上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。到可以互补的粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点

14、。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。dna重组的基本模式切（割目的基因和载体）转转-宿主菌或受体细胞宿主菌或受体细胞真核系统 酵母菌酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞原核系统 大肠杆菌 枯草杆菌感受态细胞感受态细胞（competent cellcompetent cell） 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源dna。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,cacl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源dna分子进入的感受态细胞(competent cells)。大肠杆

15、菌细胞大肠杆菌感受态细胞得到噬菌斑或单菌落与重组dna共同冰浴而后42短暂热刺激cacl2处理50-100mmol/lcacl2 转化转化e.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源dna进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将dna溶液加入到溶液加入到cacl2中，然后在强烈震荡下加入由中，然后在强烈震荡下加入由na2hpo4

16、和和nah2po4组成的组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将dna包裹在沉淀中。将这包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将dna导入到细胞中。导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免dna被细胞被细胞内的核酸酶水解。内的核酸酶水解。基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将dna溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使dna吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。激光微束穿孔法：利用直径

17、很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使dna进入细胞。显微注射法：利用毛细管直接将dna注入细胞内。脂质体（liposome）介导法：将dna包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将dna导入细胞内。多聚物介导法：利用多聚物如peg、二乙胺乙基葡聚糖（deae葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、dna混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。dna重组的基本模式切（割目的基因和载体）阳性重组子的阳性重组子的鉴定鉴定 1、根据重组载体的标志作筛选)-插入失活法-互补法 2.限制性酶切法 3.pcr法 4.杂交筛选法 5.免疫学方法

18、6.核苷酸序列测定法菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入插入灭活法灭活法进行筛选。如进行筛选。如pbr322中带有抗氨苄青中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培霉素的培养基上能够生长，

19、而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。 如果外源如果外源dna插入，氨卞青霉插入，氨卞青霉素抗性基因失活素抗性基因失活 如果外源如果外源dna插插入，四环素抗性基入，四环素抗性基因失活因失活pbr322质粒结构pbr322amptet-互补法互补法蓝白筛选蓝白筛选现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（lacz）的调控序列和n端个氨基酸偏码区（全长1201氨基酸）。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌是z基因突变型，只含编码半乳糖苷酶端的序列。当外源基因插入时，在iptg（异丙基硫代-d-半乳糖

20、苷）诱导下合成半乳糖苷酶n端片断,和受体菌的c端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的半乳糖苷酶,称互补。具有互补的细菌培养在含iptg及x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-d-半乳糖苷）的培养基上.x-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。iptg起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。-互补法互补法限制性酶切法经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制

21、酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其dna，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。pcr法法利用的目标引物(例如分离目的基因所使用的引物),抽提需要筛选的克隆的重组dna作为模板,进行pcr扩增,根据是否扩增出目的片段来确定阳性克隆.杂交筛选法杂交筛选法为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的基因部分互补的dna片段作为探针，与含有重组体的细菌片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结

22、果为阳性，即可确定菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。重组体中带目的基因。32p标记的dna分子探针 杂交 放射自显影法分子杂交依据：碱基互补配对原则合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记）升高温度或改变ph使dna变性分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库中的一个dna片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。步骤：滤膜（固定抗体）+dna序列分析法序列分析法 该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。actgaaggctdna重组的基本模式切（割目的基因和载体）原核生物基因结构和表达特点原核生物基因结构和表达特点1.原核生物染色

23、体原核生物染色体dna是裸露的环形是裸露的环形dna，其，其转录和翻译是偶联的连续进行。转录和翻译是偶联的连续进行。 2.原核生物形成多顺反子原核生物形成多顺反子mrna：mrna在合在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。肽链。 3、一般不含内含子（、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后），没有转录及翻译后加工系统加工系统。 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子操纵子。操纵子操纵子是一组功能上相关，受同一调是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位控区控制的基因组成

24、的一个遗传单位。启动子启动子(promoter, p)是指能被是指能被rna聚合酶识聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段别、结合并启动基因转录的一段dna序列。序列。 一般长一般长40-60bp，富含，富含a-t碱基对碱基对 具有保守序列：具有保守序列： -10区（区（pribnow box）：）：tataat -35区：区： 终止子（终止子（terminatorterminator，t t）: :位于基因位于基因33端端, ,给予给予rnarna聚合酶转录终止信号的聚合酶转录终止信号的dnadna序列序列 5、原核生物中参与转录的基因结构：、原核生物中参与转录的基因结构：翻译起始密码子翻译起

25、始密码子aug 或或gugsd顺序（顺序（shine-dalgarno）：）：aug上游上游3-11 bp长约长约3-9bpmrna与与16s核糖体亚基间的识别与核糖体亚基间的识别与结合序列结合序列 6、与翻译有关的原核细胞结构：、与翻译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点核糖体结合位点人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有几十年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。设计

26、外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌中表达所需要的元件，包括转录起始必需的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列等；外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之配套的调控基因等；外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点；此外还应具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复制必需的复制起始序列、筛选标志如抗药性基因等。原核表达载体原核表达载体(expressing vector) 特点：带表达构件转录和翻译所需的dna序列 大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克

27、隆位点转录终止信号 启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体pl启动子、t7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,rbs)：起始密码子(atg)和sd序列 转录终止序列影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：原核表达系统的缺点原核表达系统的缺点没有真核转录后加工的功能，不能进行没有真核转录后加工的功能，不能进行mrna的剪接，所以只能表的剪接，所以只能表达达cdna而不能表达真核的基因组基因；而不能表达真核的基因组基因；没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而、磷酸化等修饰，难以形成