有机柱-薄色谱(知识归纳)

1、第三章色谱分离技术早期，因采用此法来分离有色物质时，常得到颜色不同的色层，故取名色（层）根据组分在固定相中的作用原理不同，色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、和排阻色谱等；根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高压液相3.1柱色谱柱色谱因在柱状管中装入适当的固体物质作为固定相而得名，通常分为吸附色谱和分配色谱，实验中最常用的是吸附柱色谱。基本原理吸附色谱的分离原理是利用混合物中各组分在不相混溶的两相（即流动相和固定 相）中吸附和解吸的能力不同（即在两相中的分配不同），当混合物随流动相流 过固定相时，发生反复多次的吸附和解吸过程，从而使混合物分离成两种或多种 单一

2、的纯组分。柱色谱可分为：干柱色谱和湿柱色谱。干柱色谱的操作 是用吸附剂填满一空柱，将要分离的混合物溶液加入柱顶，使溶 液借毛细作用和地心引力向下移动而将各组分展开分离。 展开完毕，将吸附剂从 柱内移出，用适当溶剂分别提取已分离的各组分层带， 回收溶剂，即得分离的各 个组分。湿柱色谱是用洗脱剂把要分离的各个组分逐个洗脱分离的一种色谱分离技术。吸附剂常见的吸附剂有硅胶、氧化铝、碳酸钙、氧化镁和活性炭等，实验室最常用的吸附剂是氧化铝和硅胶，其中氧化铝极性更大一些。氧化铝分为三种:中性氧化铝：PH值约为7.5,用途最广，适用于中性物质分离，如醛、酮、酯、醌等有机物酸性氧化铝：PH值约为4,适用于分离酸

3、性有机物。碱性氧化铝：PH值约为10，适用于分离碱性有机物。硅胶略带酸性由于样品是被吸附在吸附剂表面，所以大小均匀、比表面积的吸附剂分离效率较 好。比表面积越大，组分在流动相和固定相之间越易达到平衡，色带就越窄。通常使用的吸附剂大小以200目为宜，太细则分离速度过慢。吸附剂的活性取决于吸附剂的含水质量分数。含水越高，活性越低。表3-1吸附剂的含水量质量分数和活性等级关系吸附剂活性等级IIIIIIIVV氧化铝的含水质量分数03%6%10%15%硅胶的含水质量分数05%15%25%38%洗脱剂能将样品中各组分完全分开的展开剂，即可作为柱色谱的洗脱剂。有时用一种 展开剂达不到所要求的分离效果，可考虑

4、混合展开剂。选择洗脱剂注意：1、洗脱剂的极性应小于样品中各组分的极性，否则由于洗脱剂与样品竞争，会导致洗脱剂被吸附在固定相上，而样品一直保留在流动相中。溶剂极性一般按以下顺序递增：己烷、石油醚、环己烷、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙醇、乙醇、甲醇、水和乙酸。2、所选择的洗脱剂必须能够将样品中各组分溶解。3、所用洗脱剂必须干燥，以免影响吸附剂的活性和分离效果。4、不同的洗脱剂具有不同的洗脱能力（即给定样品沿着固定相的相对移动能力）操作方法1、装柱：湿法装柱和干法装柱2、上样及洗脱3、收集组分。本实验是以小型层析柱分离偶氮苯与邻-硝基苯胺的少量混合溶液。所用主要仪器及药品为：层析柱：长2

5、5cm，内径1 cm吸附剂：市售中性氧化铝（100 目, U川级）10g。淋洗剂：1,2-二氯乙烷与环己烷等体积混合液 80100mL ,95%乙醇（备 用）。待分离混合样：1 %偶氮苯的1,2-二氯乙烷溶液与1 %邻-硝基苯胺的1,2-二氯乙 烷溶液的等体积混合液约1 mL 0（1）湿法装柱：将洗净晾干的层析柱中注入约为柱容积 1/4的淋洗剂。将淋湿 的一小团脱脂棉推入柱底狭窄部位（勿挤压太紧），上面加盖一张直径略小于柱 内径的滤纸片。将10g中性氧化铝在小烧杯中用淋洗剂调成悬浊状。打开柱下 活塞调节流速约1滴/秒，将制成的悬浊液在自柱顶注入，可敲击柱身以使吸附 剂沉积均匀。在此过程中应始终

6、保持吸附剂沉积层上面有一段液柱。吸附剂加完 后关闭活塞，将一块滤纸片盖在吸附剂沉积面上。（2）加样：打开柱下活塞放出柱中液体，待液面降至滤纸片时关闭活塞，将1 mL 待分离的混合样液沿柱内壁加入。打开活塞，待样液液面至滤纸片时关闭活塞。 用干净滴管吸取淋洗剂约0.3 mL沿加样处冲洗柱内壁。再打开活塞将液面降至 滤纸处。依上法重复操作直至柱壁和顶部的淋洗剂均无颜色。（3）淋洗和接收：加入大量淋洗剂，打开柱下活塞，控制流出速度为1滴/秒。观察柱中色带下行情况。随着色带向下行进逐渐分为两个色带， 下方的为橙红或 橙黄色，上方为亮黄或微带草绿色，中间为空白带。当前一色带到达柱底时更换 接收瓶接收（在

7、此之前接收的无色淋洗剂可重复使用）。当第一色带接收完后更 换接收瓶接收空白带，当空白带按完后再换接收瓶接收第二色带。吞一席制图1柱色谱装置3.2 纸色谱（PPC）基本原理纸色谱是以滤纸作为载体，让样品溶液在纸上展开达到分离的目的。纸色谱法的原理比较复杂，主要是分配过程，纸色谱的溶剂是由有机溶剂和水组成的， 在滤纸的一定部位点上样品，当有机相沿滤纸流动经过原点时，即在滤纸上的水 与流动相间连续发生多次分配，结果在流动相中具有较大溶解度的物质随溶剂移 动的速度较快，而在水中溶解度较大的物质随溶剂移动的速度较慢，这样便能把混合物分开。实验装置图2纸色谱图3纸色谱滤纸条点样1.层析缸2.滤纸3.展开剂

8、本实验是以纸色谱分离几种氨基酸为例本实验以饱和水的正丁醇溶液作展开剂， 通过实验测出丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸的Rf值，并分析测定未知试样的成分或组成。1. 滤纸的选择滤纸的质量应厚薄均匀，能吸附一定量的水，可用新华 1号，切成纸条，大小可 自由选择，一般为3X20cm，5X30cm，8>50cm等。滤纸用前应经过试验，观察 分离效果，色点边界清晰为好。2. 配置展开剂正丁醇：水：乙酸=4 : 5 : 1 （体积比）按他们用量比例，先将正丁醇与水在分液 漏斗中一起振摇1015分钟，然后加乙酸再振荡。静置分层，下层弃去，上层 作为展开剂，将展开剂倒入层析缸内盖上盖，放置 0.5小时，使缸内形

9、成饱和蒸 气。3. 显色剂95份正丁醇及5份（体积比）2 mol?_-1的CH3COOH混合作为溶剂，加入茚三 酮配成0.1%的溶液。4 .取5X30cm的滤纸一张，在距离一端2 cm处用铅笔轻划一直线，在直线上用 铅笔轻轻地划4个“X号，并注上号码1, 2, 3，在各点上用毛细管（管口 要齐）分别点上谷氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸已知样，在第四点上，点上未知样， 每加一点样品就用吹风机以温热的风吹干，每个样品点三次。将层析液倒在一培养皿中（约 11.5 cm深），先将点好样的滤纸上端夹在支架 上，下端放在皿的外边（不要与溶剂接触），盖上层析缸盖。10分钟后，滤纸吸 附蒸汽达到平衡，用夹子将滤纸下端

10、迅速放入皿中，溶液因毛细现象逐渐向上渗 透扩散，当前沿距样15cm左右处停止展析，取出滤纸，用铅笔划出溶剂前沿线。晾干，喷上显色剂到刚好润湿滤纸，用吹风机吹干，并在8590 C烘干，则显出紫红色斑点。（1）计算已知样和未知样各点的 Rf值。（2）根据已知样和未知样各点的 Rf值。做定性分析。比移值（Rf）表示物质移动的相对距离只彳=溶质移动的距离f =溶液移动的距离例如:12cmRf （化合物 A） = 30空=0.253.3 薄层色谱（PPC）薄层色谱（Thin Layer Chromatography）常用TLC表示，又称薄层层析，属于 固-液吸附色谱。薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（10X

11、3cm左右）上均匀的涂 一层吸附剂或支持剂，带干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离 薄层板一端约1cm处的起点线上，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开 槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出， 干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的 距离，计算比移值（Rf）：溶质移动的距离Rf =溶液移动的距离3.3.1实验装置色谱展开毛细管点样以薄层色谱分离偶氮苯和邻-硝基苯胺为例操作步骤（1）配制CMC溶液：按照每克羧甲基纤维素钠（CMC）100 mL蒸馏水的比 例在圆底烧瓶中配料，加入几粒沸石，装上回流冷凝管，在石棉网上

12、加热回流至 完全溶解，用布氏漏斗抽滤。也可在配料后用力摇匀，放置数日后直接使用。（2）调浆：称取适量的硅胶H于干净研钵中，按照每克硅胶H2.53mL溶剂 的比例加入CMC溶液，立即研磨，在半分钟内研成均匀的糊状。（3）制板：将已经洗净烘干的载破片水平放置在台面上，用干净牛角匙舀取糊状物倒在载玻片上，迅速摊布均匀。如不均匀，可轻敲载玻片侧沿使之流动均 匀。一般不可再加入糊状物，否则会形成局部过厚。每块板 1满匙，铺制6块板 约需硅胶H3.5g，铺制过程应在35分钟内完成。(4) 活化：待硅胶固化定型并晾干后，移入搪瓷盘内，放进烘箱烘焙。升温 至110120 C保持半小时，切断电源。待冷却至不烫手

13、时取出使用。如不很快 使用，应放进干燥器中备用，或装进塑料袋中扎紧袋口备用。(5) 点样：在距薄层板一端约1 cm处用铅笔画一水平横线作为起始线。用平口毛细管在起始线上点样，每块板上点两个样点，样点直径应小于2 mm，间距至少1 cm。如果溶液太稀，样点模糊，可待溶剂挥发后在原处重复点样。可留下一块薄层板作机动，其余五块板每块上各先点一个混合样点，另一样点依次为：(a)混合样，(b)偶氮苯；(c)邻硝基苯胺；(d)色带I； (e)色带U。(6) 展开：在展开槽中加入适量展开剂，展开剂的深度在立式展开槽中约0.5 cm，在卧式展开槽中约0.3 cm。盖上盖子放置片刻。将点好样的薄层板放入， 使点样一端向下，展开剂不得浸及样点。盖上盖子观察展开剂情况，当展开剂前 沿爬升到距离薄板上端约1 cm时取出，立即用铅笔标出前沿位置，依次展开其余各板。(7) 测量和计算：用直尺测量展开剂前沿及各样点中心到起始线的距离，计 算各样点的Rf值。(8) 比较分析：将(a), (b)，(c)三块板并排平放在一起，比较分析由混合样点所分得的样点中哪一个是偶氮苯，哪一个是邻-硝基苯胺，并从分子结构解释其Rf值