清喉咽合剂中连翘苷不同定量方法对比研究

1、清喉咽合剂中连翘昔不同定量方法对比研摘要：目的对比不同分析方法对清喉咽合剂中连翘 昔含量的影响。方法采用高效液相色谱法(hplc)和三波 长-分光光度计对清喉咽合剂中连翘昔进行含量测定。结果 连翘昔在0. 025 10. 125 6 mg/ml范围内，分别在波长 278.5、248.0、272. 4 nm处测定吸收度时,aa与浓度c之 间呈现较好的线性关系，回归方程为aa=89. 705c-0. 041, r=0. 999 7；平均加样回收率为97.48%, rsd二1. 88%。三波长 测定法与hplc测定结果比较，差异无统计学意义。结论 三 波长测定法对供试品制备要求简单，操作简便易行，试

2、验的 重复性好，效率髙，可以作为该制剂组分含量测定方法。关键词：三波长-分光光度法；高效液相色谱法；清喉 咽合剂；连翘昔d0i： 10. 3969/j. issn. 1005-5304. 2013. 03.025中图分类号：r284. 1文献标识码：a文章编号： 1005-5304 (2013) 03-0065-02连翘为清热解毒药，归肺、心、小肠经，其主要功效为 清热解毒、消肿散结、疏散风热，临床上用于痈疽、凛痂、 乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、 神昏发斑、热淋涩痛等1。在中药制剂中使用较为广泛， 主要含有木脂素类（如连翘昔、连翘昔元、连翘酯昔a等）、 黄酮类（如芸香昔

3、等）、三菇类（如齐墩果酸、熊果酸、白 桦脂酸等）。由于木脂素类化合物热稳定性较差，故在制剂 生产过程中很有可能受热分解，故本研究选择清喉咽合剂作 为考察对象，对制剂中的连翘昔进行定量评价分析，以对含 有此类的中药制剂生产提供参考。1仪器与试药岛津lc2010cht型高效液相色谱仪（四元泵、在线脱气、 自动冷却装置、全自动进样器、紫外检测器），uv-2401pc型 紫外可见分光光度计（日本岛津），梅特勒-托利多ab135-s 双量程电子天平（瑞士），as10200adt型超声波清洗器。清喉咽合剂（中国人民解放军第155医院院内制剂，批 号 20110725. 20110408、20111108）

4、,连翘昔对照品（科翔 生物科技有限公司，批号08-2011,经检测纯度大于98%）； 色谱甲醇（山东禹王实业有限公司化工分公司，批号 20110103061）,双重蒸馆水，其他试剂均为分析纯。2溶液制备2. 1供试品溶液的制备精密吸取清喉咽合剂2 ml至100 ml容量瓶中，加水稀 释至刻度，再精密取5 ml至10 ml容量瓶中，加入蒸纟留水 稀释至刻度，即得。2.2对照品溶液的制备精密称取经110 °c干燥至恒重的连翘昔对照品3. 14 mg, 置25inl容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制 成浓度为0. 125 6 mg/ml的连翘昔对照品溶液。2.3阴性对照溶液的制备

5、取与清喉咽合剂处方药材比例相同的中药饮片适量，连 翘除外，粉碎过3号筛，取相当量的处方用量于容量瓶中， 加入甲醇，按照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。3三波长测定及方法学考察3. 1三波长的确定清喉咽合剂中连翘昔的最大吸收波长为278. 50 nm,而 在此波长处，提取液的其他组分对其有干扰。根据三波长分 光光度法测定原理，采用1 cm石英比色皿在波长200800 nm 范围内扫描，绘制供试品、对照品、阴性对照吸收曲线（见 图1）,采用作图法和计算法确定3个测定波长。如图1所示，选取连翘昔最大吸收波长278. 5 nm为入1, 阴性对照溶液吸收波长248. 0 nm为入2,按作图法粗略找到

6、 使阴性干扰的aa值为0的入3为273 nm。按公式 a a=a2-（入 3-入 2 ） a1+ （入 2-入 1 ） a3 / （入3 -入2） + （x2-x1），求得使干扰组分 a值为0的a3对应的 波长入3,见表lo可知精选入3为272.4 nm。3.2标准曲线的绘制精密量取0. 125 6 mg/ml的连翘昔对照品溶液1. 0、2. 0、 3.0、4.0、5.0 ml,分别置于5 ml容量瓶中，加入甲醇使 其溶解，摇匀，放至室温，定容，即得。再分别在278.5、 248.0、272. 4 nm波长处测定吸收度，并扣除甲醇溶液空白， 以aa和浓度c进行回归计算，得回归方程 aa=89.

7、 705c-0. 041,相关系数 r=0. 999 7,可见，在 0. 025 1-0. 125 6 mg/ml范围内，连翘昔浓度与aa有良好的线性 关系，可按标准曲线法进行定量分析。3. 3稳定性试验按“2.1”项下方法制备供试品溶液并进行稳定性试 验，结果表明，样品放置12 h以上，测得其吸光度值不变, 表明该供试品溶液在12 h内成分稳定。3.4重复性试验取供试品溶液5份，按上述方法重复测定连翘昔含量， 结果表明，连翘昔含量为0. 072 6 mg/ml, rsd=1. 37%,本方 法重复性良好。3. 5加样回收率试验精密吸取清喉咽合剂1 ml于200 ml容量瓶中，再精密 加入连翘

8、昔对照品溶液适量，按“2.1”项下方法制备供试 品溶液9份，根据所确定的测定条件，在该波长下测定供试 品吸收度，求得其相关参数。结果见表2。3. 6样品含量测定取3个批号的清喉咽合剂，按“2.1”项下方法制备供 试品溶液，在选定的3个波长处测定其吸收度，每个批号平 行3份，根据绘制的标准曲线计算连翘昔的含量。按照2010 年版中华人民共和国药典清喉咽合剂项下高效液相色谱 (hplc)含量测定方法进行定量分析。结果见表3o经配对 检验，t=l. 804 (n=9), p=0. 093,差异无统计学意义。4讨论连翘昔属于木脂素类化合物，其结构母核中含有内酯 环，在热碱性溶液中容易开环发生分解，对光

9、线较为敏感， 长时间照射会改变其化学结构，因此，在含有连翘的中药制 剂生产过程中，很容易被破坏分解掉，在实际生产中应特别 注意热不稳定类成分的提取。在对该制剂进行含量测定中发 现，市售的某些制剂中，连翘昔几乎损失殆尽，甚至无法对 其进行准确定量。在对连翘昔进行三波长定量分析时，考虑到连翘内化学 成分的组成，其中香豆素类的药理作用较为明显，故采用香 豆素代表性的连翘昔作为对照品进行光谱扫描及含量测定。 在连翘药材中可能有同样母核的化合物较多，可能对其定量 产生一定的影响，而三波长测定的方法能有效避开这一影 响，使含量测定结果更加准确。在供试品制备过程中加入甲 醇处理时有絮状沉淀产生，对试验结果有

10、一定的干扰，造成 回收率偏低，在改用水做溶剂处理时，沉淀较少，并且对回 收率影响较低，故而采用水作为溶剂制备供试品溶液。在光谱扫描中发现，干扰组分的最大吸收与连翘昔的最 大吸收波长相近，故入1选择了连翘昔的最大吸收波长，在 选择入2时避开干扰成分的最大吸收，选取了吸收度较为平 缓的248 nm作为检测波长，经过作图法和计算法相结合寻 求最佳的入3位置，有效避开了溶液中其他成分的干扰。hplc首先要用色谱柱将化合物分离，再通过外标法或内 标法进行定量分析；而三波长测定法是通过官能团紫外吸收 的吸光度不同而进行定量。两者测定原理截然不同，但通过 对比分析可以看出，二者测定结果差异无统计学意义。且三 波长测定法较hplc更节约成本及溶剂，操