应用随机扩增多态DNA标记进行的遗传分析

1、应用随机扩增多态 DNA标记进行的遗传分析Scott V. Tingey* and Joseph P. de1 TufoDu Pont Agricultura1 Products, E.I. du Pont de Nemours & Company, Wilmington, Delaware 19880-0402多年来， 遗传学准则被应用于作物品种的改良， 并取得了巨大的成就。 一些作物物种， 尤其是玉米、 小麦和番茄，因为对粮食的首要重要性， 它们被当作模式遗传系统。最近， 在育种和模式遗传系统中取 得的进展实际上依赖于一个基因型的表型分析。因为特征遗传可 能性的一个功能是以表型为基

2、础的基 因分析或是选择方案的效率， 所以像环境、 多基因性的和定量的继承物、 或者部分的和完整的显性经常 打乱一个基因特征的表达。通过基于 DNA 的诊断分析来直接鉴定基因型，可以减轻许多表型分析的困 难。因此，基于 DNA 的遗传性标记将来能被整合进一些植物系统中，期望能够在将来的植物育种中发 挥重要的作用。以 DNA 为基础的诊断标记的功效很大程度上是由用于显示 DNA 多态性的技术决定的。 当前， 选 择许多物种的技术是限制性片段长度多态性分析。 限制性片段长度多态性分析通过限制性内切核酸酶消 化检测 DNA 多态性，同 DNA 点杂交联系在一起，限制性片段长度多态性分析一般来说是正在消

3、费的 时间和集中的劳力。在过去一些年中，聚合酶链式反应技术曾引起一些新颖的基于选择的 DNA 扩增的 遗传学分析方法的发展。 这些新分析方法优点中的其中一个是比起传统技术来它们更容易控制以实现自 动化。同时，它们容易执行，而且更适合于这样的实验：很多个个体的基因型由少数基因位点决定的。 很遗憾，由于 DNA 序列信息的一个前提条件，这些分析方法在应用上受到限制。几乎两年前，一个新的遗传学分析方法是独立的由两个不同的实验室发展出来的（ Welsh and McClelland ，1990；Williams 等， 1990）。这个程序被我们称为 RAPD-随机扩增多态 DNA 分析，它仅 用一个随

4、意的核苷酸序列的简单引物来进行 DNA 扩增分析，从而检测核苷酸序列的多态性。在这个反 应中，一个单一物种引物同 DNA 模板的两条相反的链上的不同位点的 DNA 序列结合。如果这些引物 结合位点在彼此的一个可扩增的距离内，一个分离的 DNA 产物通过循环扩增产生。每个扩增产物的存 在能够识别在基因 DNA 和寡核苷酸引物之间的存在于扩增产物的每个尾端的完整的或部分的核苷酸序 列同族性。 平均起来， 每个引物会指导基因组中的一些分离位点的扩增， 从而使分析方法成为审查不同 个体之间核苷酸序列多态性的有效途径。 例如，发现 RAPD 多态性的频率在拟南芥中显示为每0.3 个引物，在黄豆中为每 0

5、.5个引物，在玉米中每一个引物，在粗糙链孢菌中为每 2.5 个引物。这种分析方法 的主要优势是不需要 DNA 的序列信息。草案同时执行起来非常快捷和简单，使用荧光性代替了放射性 （ Williams 等， 1992）。因为 RAPD 技术是以扩增为基础的分析方法，所以仅需要毫微克数量的 DNA ， 并且自动化是可行的。1 RAPD 分析的应用在过去的两年里， 有一些 RAPD 分析方法的应用得到了发展。 这些技术中的每一个都提高了 RAPD 分析中的 DNA 序列多态性检测的效率。 RAPD 技术为以前从未获益于分子标记使用的生物学系统提供 了基因分析的工具，从而很快获得了广泛的认可和应用。1

6、.1 遗传图谱的发展过去在实践中首批使用 RAPD 标记，其中在建立高密度遗传图谱中曾使用过。通过使用一个更有 效的分析方法， Reiter 等人（ 1992）在仅仅每人四个月的时间内成功将超过250 个新基因标记插入一个 重组近亲繁殖的拟南芥种群中 ,无疑证明了 RAPD 标记物能够快速精通一个总体的和局部的遗传图谱的 功效。在历史上， 许多重要作物系统缺乏基因标记。 例如，对针叶树的遗传联系分析进行很慢，主要是归 因于其基因组的庞大和产生隔离的 F2 代而固有的困难 （ Carlson 等，1991）。Carlson 等（ 1991）和 Chaparro 等（ 1992）在最近曾展示： R

7、APD 分析的快速和效率使针叶树的图谱制作成为合理的尝试。例如，Chaparro等（ 1992）在仅仅每人六个月的时间里能够制出火炬松一个191 标记的 RAPD 图谱。拟南芥和火炬松的遗传图谱以前所未有的速度合成，同时利用了每个系统的独一无二的生殖生物学。因为 RAPD 多态性是核苷酸碱基改变的结果，核苷酸碱基变化改变了引物结合位点，或者导致 扩增区域内的插入和删除（ Williams 等， 1990；Parks 等， 1991），多态性由一个单个位点的扩增产物的 存在或缺失表现出来。这也意味着 RAPD 技术趋向于仅提供显著的标记物。包含一个等位基因的两个 复制体的个体们在数量上并不区别于

8、这些仅包含这个等位基因的一个复制体的个体们。 用突出的标记作 图的缺点是标记受到排斥，例如标记定位在分离的染色单体上，这些能够在 F2 代中发现，所以这些标 记只能提供很少的信息给基因距离的估计。 因此，当用突出的标记作图谱时， 仅仅耦合的标记能够工作， 定位在一个单链染色体上的免疫电泳标记能在回交的或重组的近亲繁殖的群体中发现， 也能在单倍体的 或者配子体的组织中发现，或者选择性地在扩增自单一母本的 RAPD 标记被作图的 F2 代中发现 （Williams 等， 1992）。基因模拟显示耦合的突出的标记作图时像每一配偶子碱基上的不突出的标记一 样有效（ Hanafey Maize 遗传学会

9、议） 。1.2 指定基因标记一些团体曾将 RAPD 分析作为识别分子标记的一个有效工具，这些分子标记位于在近同基因系的 形成过程中基因渗入的一个基因组的区域内（ Klein-Lankhorst 等， 1991； Martin 等， 1991；Paran 等， 1991）。通过定义，在两个相近同基因植物之间具有多态性的基因组的任何区域潜在的同基因渗入的特 征联系在一起。因此， Klein-Lankhorst 等（ 1991）能通过检测一个番茄置换链识别对于番茄的六号染色 体特定的 RAPD 标记，而 Martin 等（ 1991）通过检测两个相近同基因系能够证实RAPD 标记和番茄中Pfo 位点

10、的联系。 Paran 等（ 1991）用不同的两套相近同基因莴苣系来识别和Dm1 、 Dm3 、 Dm11 位点联系的 RAPD 标记。 在每一个验定的多个碱基上， RAPD 标记的效率比起用 RFLP 技术检测这些多态性 来是其 4到 6倍，并且在时间上和劳力上的效率大概是其十倍多。 这个技术的另一个优点是： 完整基因 组的基因图谱不要求识别同注重的特征联系在一起的标记，相反，可以致力于基因组中的特定区域。然而使用相近同基因系识别同一个遗传特征相联系的标记存在两个缺点。 第一个缺点是它需要数个 回交代系来获得相近同基因系。 第二个缺点是： 所得的基因组的一些区域很频繁的不经意间和相近同基 因

11、系相互基因渗入。 这导致了一些相近同基因系之间的标记多态性的识别，而这些相近同基因系和正在研究的特征没必要联系起来。1.3 建造基因库策略最近，另一种技术发展起来，它是用来识别同基因组上的非常特殊的区域相连锁的基因标记。Arnheim 等（ 1985）概述了一个基因组建库策略， 这个策略允许 RFLP 标记被指定在基因组的一个区域， 这个基因组作为在特殊位点选择的结果并不是平衡连锁的。这个策略要求将一些染色体组 DNA 建库， 而这些染色体组 DNA 从起源上是固定在一个特殊的位点上。谈到群体中的其余的，和这个位点连锁的 标记通过它们的非平衡连锁被识别。这种途径的局限是它依赖于 RFLP 技术

12、，而 RFLP 技术识别一个基 因组的多态性的区域的效率低， 而且更为重要的， 前提是非平衡连锁存在于在群体来源之内的所关注的 位点上。最近， Michelmore 等( 1991)描述了应用 RAPD 标记来有效的筛查同基因组的特殊区域连锁的标 记。这个方法叫做总隔离分析， 使用从一个简单的群体中分离出来的个体中获得的两个膨体 DNA 样本。 每一团是由在一个特定的表型或基因型不同的个体们组成的， 或是由一个隔离群体中任何一个存在极端 的个体们组成的。 对于简单的遗传学特征， 除了在基因组和挑选的位点连锁的区域内的位点， 在基因组 上的位点都应表现为平衡连锁。 对于间隔的亲本等位基因建立的库

13、之间， 和这个位点连锁的标记应该表 现出多态性。 因为许多隔离的个体们用来建立基因库， 所以没有和目标位点连锁的基因组的区域只有一 个很小的机率也在库之间表现出多态性。 随机引物能够被用来有效的扩增来自每个基因库的位点， 并且 还能识别和所关注的特征联系在一起的 RAPD 多态性 。Michelmore 等( 1991)曾成功地应用这项技术 找到对应于莴苣上的 Dm5/8 位点的标记。这项技术的优点是： 标记是指定在基因组内的一个非常小的位点， 同时和相近同基因系分析比较起 来，识别错误积极标记的可能性小( Michelmore 等， 1991)。关于基因组的选定的区域，来自于一个 F2 群体

14、的选择将常常是非平衡连锁， 并且标记能够被定位在能够应用的选择方式的任何位点上， 不是表型 就是基因型。Giovannoni 等( 1991)证明：以对来自于存在的作图群体的RFLP 基因型了解为基础，对于在一个指定的染色体间隔上的相反的亲本等位基因，一个建库策略的使用能够创建来自于纯合子个体的 DNA 库。这个方法过去用来将对应于负责果实成熟和花梗除去的番茄基因组的 RAPD 标记作为目标。Reiter 等( 1992)过去使用这种建库策略来识别对于拟南芥的1 号染色体特殊的 100 RAPD 标记。当遗传图谱接近饱和， 对表型或是基因型的建库将允许研究者改变一个随机的途径来达到图谱饱和，

15、更有 效的集中在基因组的特殊区域上。1.4 人口遗传学人口遗传学 ( Hedrick,1992 )是指关于 RAPD 技术的使用发展最多的研究领域。 RAPD 标记被用来创 建 DNA 指纹，其目的为研究真核生物和原核生物的个体特征和分类学关系(Caetano-Anoll és 等., 1991a;Hu and Quiros, 1991; Welsh 等 , 1991; Wostemeyer 等 ., 1991; Hadrys 等., 1992; Kresovich 等 ., 1992; Lark 等., 1992; Stiles 等., 1992; Wilde 等 , 1992)。

16、一个重要的问题是在个体之间分配的相等摩尔重量的 RAPD 谱带是同源特征 (继承于一个共同的祖先的特征) 还是同种特征 (独立的来自于同一个种群的特 征)。它看起来可能是：紧密联系的个体们可能从一个共同的祖先那共同继承一份特征状况，同时它们 不可能独立的获得相同的特征。 Williams 等 (1992) 通过使用单一的 RAPD 谱带作为检测 RAPD 产物的 DNA 点的同源特征的杂交探针来证明这是实例。在一个琼脂糖凝胶的分辨率的限制下，扩增自不同种 的属间氨基乙酸的不同 RAPD 谱带，通过相对迁移率来看出同源性，通过杂交展现出同源性。一些团体曾就 RAPD 标记作报告称其为系统发生信息

17、的来源。 Arnold 等. (1991)成功地用 RAPD 标 记测试在芸苔和 1.hexagona之间的种间核基因流动， 同时成功地研究 1.nelsonii 的假定杂交来源。 Hu and Quiros (1991) 能够展示：仅来自四个随机引物的扩增产物足够区别14 种不同的花茎甘蓝和 12 种不同的菜花的栽培品种( Brassica oleracea L)。 RAPD 标记实际上也被用来估计种质资源的遗传多样性的量。 使用仅 25 种不同的十倍体寡核苷酸引物， Kresovich 等 (1992) 收集了作为 B. oleracea L. 和 B. rapa L. 代表的个体们的一个

18、测验系列中的 140 个不同多态性特征的信息。 他们展示了这种检验用来区别在一个 种质资源的不同个体的效用，同时，区分紧密联系的个体们的能力只不过是被观察的 RAPD 谱带的个 数的功能。 RAPD 标记提供了一个发现这些多态性特征的有效技术。通过使用一个像五个核苷酸一样短的随机的引物， 同时与银染色剂结合来增加 DNA 条带察觉的敏 感度， Caetano-Anoll és 等. (1991a)为许多不同种类制作出一个详细的相对复杂的DNA 指纹。这个途径称作 DNA 扩增指纹，这个途径最近被评论过( Caetano- Anoll sé 等 ., 1992b)，并承诺从每个扩增产生更 多的遗传信息。2 结论DNA 诊断现在很好的成立为一个检验位点、染色体和整个基因组水平的多样性的方法。随着技术 逐渐先进， DNA 测序检验变得更容易使用，筛查核苷酸序列多态性变得效率更高，对于遗传学研究团 体来说一个更宽泛的界面成为可能。 根本的遗传学分析应该建立在任何所研究的位点上的完整 DNA 序 列的测定。逐渐增长的遗传学分辨率应该通过对位点上的 DNA 的一个大点邻近片断的测序获得。作为 这个的前奏，这有一些好的 DNA