缝隙连接蛋白在肝细胞癌中的异常表达对肝癌进展的影响及其机理研究

1、缝隙连接蛋白在肝细胞癌中的异常表达对肝癌进展的影响及其机理研究目的：连接蛋白(connexin,Cx)及其形成的缝隙连接(gap junction,GJ)的表达和功能异常与肿瘤的发生、开展密切相关 , 一般认为 Cx/GJ 是肿瘤的抑制因子 和潜在的治疗靶点。但是关于 Cx/GJ 在人原发性肝细胞肝癌中表达和作用还不清 楚, 不同的研究结果存在争议 , 本课题深入研究了人肝脏细胞主要表达的 Cx32,Cx43,Cx26在人肝细胞癌中的表达情况，并分析了上述Cx的表达与肝癌临 床进展之间的关系 ;旨在了解 Cx/GJ 在肝癌不同开展阶段之中表达分布规律 , 初 步说明Gx/GJ在肝细胞癌发生开展

2、中的作用及其机制；为Cx/GJ/作为防治肝癌新 分子靶点的价值和意义提供关键证据。方法：1. 收集 97例肝细胞癌手术患者的新鲜组织和石蜡包埋组织标本 (包括 肝癌组织 , 对应癌旁组织 , 远端正常组织 ), 具有完整病历资料和预后随访信息 ；2. 免疫组织化学检测石蜡包埋的肝癌组织、癌旁组织、远端正常肝组织标本中 Cx26,Cx32,Cx43的蛋白定位、分布情况；3.应用 Western Blot和RT-qPCF分别 检测新鲜冻存的肝癌组织和癌旁组织、远端正常肝组织标本中 Cx32,Cx43,Cx26 的蛋白和mRNAfe达水平;4.用Chi-Square test 和Person列联系数

3、分析Cx32 的表达与人肝细胞癌临床病理诸因素 (如临床分期 , 组织分化, 肿瘤最大径等 )的 关系;5.Kaplan-Meier method,log-rank test和多因素Cox回归模型筛选分析Cx异常表达与肝癌预后的关系;6.用免疫组织化学和western Blot方法检测肝 癌组织中Cx32蛋白与EGFR言号传递通路上EGFR5白及其下游 mTORERkStat3 蛋白表达的相关性。结果 ：1. 免疫组织化学染色显示肝癌组织和癌旁组织及远端 正常肝组织中 Cx32,Cx43,Cx26 的蛋白表达均存在差异 ,Cx32 在癌组织中表达显 著增加,主要分布于细胞质 , 常见核旁聚集现

4、象 ,Cx32 在癌旁组织和远端正常肝 组织也见表达，但主要分布于细胞膜上,少量在胞浆中，Cx26表达在癌组织和癌 旁组织及远端正常肝组织中未见明显差异 , 分布于细胞膜及细胞质中。Cx43在癌组织中的表达量减少或呈阴性,主要分布于细胞质中，Cx43在癌旁 组织及远端正常肝组织中分布于细胞膜及细胞质中 , 以膜分布为主 ;2.96 例新鲜 肝癌组织,癌旁组织,远端正常肝组织 Western blot和RT-qPCF分别检测Cx的蛋 白、m RNA勺表达水平。(1)在肝癌组织,癌旁组织和远端正常肝组织中,Cx32蛋 白的表达量分别为 4.6014±0.2388、 1.1433±

5、;0.1006 和 1.0583±0.0693, 与癌 旁组织及远端正常肝组织相比 ,Cx32 蛋白的表达量在肝癌组织明显升高 ,差异有 统计学意义(P<0.05);Cx32 的 mRNAS达水平分别为 0.8356 ± 0.1255、0.7779 ± 0.1573 和 0.7754± 0.0931, 无明显差异。(2) 在肝癌组织 , 癌旁组织和远端正常肝组织中 ,Cx43 蛋白的表达量分别为 0.6303±0.0714、1.3152±0.1456 和 1.5458±0.1792; 与癌旁组织及远端正常肝 组

6、织相比,Cx43蛋白的表达量在肝癌组织明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);Cx43的 m RNA表达水平分别为 1.0772 ± 0.1216、1.1693 ± 0.1317和 1.0887±0.1260, 也无显著差异 ;(3)Cx26 蛋白表达量在肝癌组织 , 癌旁组织和 远端正常肝组织中分别为 1.5203±0.1126、 1.4200±0.1212 和 1.4200± 0.1212,Cx26 无显著差异;Cx26 的 mRN表达水平分别为 0.6325 ± 0.0873、0.6983 ±

7、; 0.0731 和 0.6884± 0.0584, 也无显著差异 ;3.Cx32 异常表达的临床意义 ,Cx32 蛋白表达水平与肝癌的病理组织分级(P<0.05,r=0.488)、临床TNM分期 (P<0.05,r=0.373)均呈正相关;4.细胞质高表达Cx32的肝癌患者预后差,术 后总生存期 (overall survival,OS) 和无复发生存期 (recurrence free survival,RFS) 比细胞质低表达 Cx32 的患者短 (OS,P=0.000;RFS,P=0.172) 。多因 素Cox回归生存分析中显示，Cx32表达上下,

8、肿瘤分化程度(病理分级)是肝细胞 癌患者术后生存时间的独立的预后评估因素。5.通过免疫组化染色和western bolt方法发现,细胞质内Cx32高表达伴发 EGFR表达增加，同时EGFR言号通路的下游蛋白mTO蛋白表达也增加。结论:1. 在人肝细胞癌组织中Cx32表达量增高，主要分布于胞浆中，膜上的分布减 少;Cx43在肝癌组织的表达明显减少,主要分布于细胞膜；Cx26的表达量在肝癌 组织中的表达不变 ,主要定位于细胞膜上和细胞质中 ;肝癌组织的细胞缝隙连接 (GJ) 减少或消失。2.Cx32 在细胞质内表达水平与肝细胞癌的病理分级 (组织分化程度 ), 临床 TNM分期呈正相关。3.CX32