流式细胞仪操作规程-SOP

1、流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2:活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3： HLA-B27 测定4: CD55CD59 测定5:干细胞检测和绝对计数6:白血病免疫分型测定7:淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子 IFN-丫 /IL-4测定8:细胞周期分析9:活化血小板检测10:血小板抗体测定11:红细胞抗体测定12:粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定（流式细胞仪）医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版（共 3 页）本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者： 审批者：批准日期：年月日文件分发部门和/或个人院档案室保管者：检验科 主任：检验科实验室：淋巴细胞亚

2、群测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中， 与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式 细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+ B淋巴细胞：CD3-, CDI9+辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+ NK细胞：CD3-CDI6+56等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞 仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群， 利用计算机软件计算出

3、淋巴细胞 亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1 .样本量1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3.样本白细胞计数应在之间。若X109/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X 109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1:单克隆抗体液体28C(CD45/4/8/3CD45/56/19/3CD4/8/3同型对照 lgG1/lgG1/lgG1CD3/19CD3/16+56 CD19-PC5Flow-Cou nt荧光微球2：

4、全血溶血试剂（Q-Prep）液体A:甲酸液体70ML室温B:碳酸钠等液体32ML室温C:多聚甲醛液体14ML室温(Optilyse C 液体室温3 :鞘液液体20L室温4:清洗液液体5L室温5:荧光微球液体10ML28C (Flow-Check)仪器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血）b.使用COULTER PREP制备系统开机-显示REA

5、DY丁亮-选择35SEC丁亮-开门-放入试管关门-自动进行溶 血-显示READY丁亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6）需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的 Flow-Count（务必做到 三同：同枪，同人，同种方法加 Flow-Count，而且加完即上机）报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度批内五次重复CV<2%参考值（百分数（绝对值）CD3+CD4+CD8+NK （175-567）Th/Ts临床意义、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标 ，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感

6、染， 自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊 断、病情判断、治疗等价值。临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE类风湿性关 节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及 HBsAg+乙肝等。Th/Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和 活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2： NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、 病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人

7、等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。(一8040d)«攸QQ&曲MWjWd HAftU五 L 严 CW<iM戈“匚1 JHhl k«4pr I匸研尸£ O | " |T|聒|瓦丛尽亦卅工鱼図|41 k 1 x |Lil>屮*!和9 II 伽 r皿4 Qlgj |I DwpmMhgn |Ai'ilirt-iT totfa 0 ch hlCkKlRTdAIDSpreOFFPEerrForr咛CFFmLkIMm Brai rite(luxeomihp! m

8、sirjAcMQh fate*Lkb Ejp|Uhh*_I r厂 CLigiwP'9 b：«b-FQh«nDbU£=-ldprrkkrrtUhIxq P*.RLE7rE17厂fll|pTCrIPHJrpruIttD厂R厂Pl£F(fl2 21 弹 fr rWv0M50mIiPi：5L rri*nF$UiSS LnFITCLcaHw*5UrtmdrHi Eabinmia jftr SelypljEi r EidkEDUPi："S«!*>irK<fe U*T fiflflt |uw» 吕g 3w | ibc!

9、e I lEk'#" |rat3 p II |H<c- MlTis fuiiHcfrfvyjE fvlmctv 皿* 虑肝'Izj 宀-g氣#r缶怜旳耳口FS RI Hi"佔 zS:R： PE：- ：wjx.3d * S OS-WkKldMBe* 3匚屯习 RjphTitbfi*®LkiT 亘i*.DcAomhaKPWBR 勻 P时xcolidIQtrttKtMl： 119KDLeTn*«wq n |HMfXJSlJdj4.k-J'ati hlfaFILh 旳LnF1I3PE (Lag TOLcfiPR EmT £

10、 |s « M « H 一 <1 Tin鱼弓亘o£ Q SJ * UII迪山口|¥ jtd !/-十S 1t ra |卜卜IT * | l»xlm.> efl-i：: poo厂厂 tlRL lip r r r r|p5Ljf| 対 Lim引希序吟 jl ICJOl «<!W、W，対椚2 v- »0gskslkr 茗务 44MDgwn 4 -tM we* F A f rr»（命名，点击save）2.画图比3知“"处uc»IN心心cm0US”82 IR结果此图为CD45圈门如果做绝

11、对计数，则N Q Q曲5 C.*| 口戸1 JI盟匚r n10 - 直弐I；t r 1律叱1 11 ft- II *J h酉<5 * | 丫f"3皀-rliri LJ minHr-心FRO 16斤门 ZokirPSxhP Zvrno 3 a=iarr5-3B-=hP-n- “ n4aiF5dSU”：M«rFai* 祁 aMPaPLtcnri wcrarizcFti * 心 MCF2rVBrfK.Fi A£X F MEM 苗tttn WFXEJHLl.fi atcfnpu. 扩卄AQ II :上山則Holl甲GiJbaa:.叩叫填写Flow-Count的浓宦耳

12、ma)。>理活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白 细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞 仪上进行分析，从而得到相应各亚群的百分数。活化淋巴细胞表面抗原为CD3+/CD25和 CD3+/HLA-DR+CD3+/CD45RO是记忆型 T细胞。CD3+/CD45RA+ 是纯真型T细胞。标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1 .样本量1ml。2样本应在采集后6小时

13、内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3.样本白细胞计数应在之间。若X109/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X 109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌贝克曼库尔特剂型规格贮存成分1:单克隆抗体液体28C(CD3/HLA-DRCD25-PC5CD3-FITCCD45RA-PECD45RO-PECD4-PC5 )2：全血溶血试剂（Q-Prep）液体A:甲酸液体70ML室温B:碳酸钠等液体32ML室温C:多聚甲醛液体14ML室温(Optilyse C液体室温3:鞘液液体20L室温4:清洗液液体5L室温5:荧光微球液体10ML28C (Flow-Check)仪器Beckma nCoulter EPIC

14、S XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血）b.使用COULTER PREP制备系统开机-显示READY丁亮-选择35SEC丁亮-开门-放入试管关门-自动进行溶 血-显示READY丁亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV<2%参考值(百分数

15、)CD3+/HLA-DR+ ± %CD3+/CD25+ ± %CD3+/CD45RO+ ± % CD3+/CD45RA+/CD4+ ± %临床意义、CD25 CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原，对其进行检测可以 判断出疾病的进程，有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗。如活化状态的 监测是对机体移植免疫状况判断的最主要依据，有助于临床选择治疗方案， CD25+/CD3+ >5-10提示排斥、持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR增 加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2. 正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在

16、数量上保持一定比 例，如果它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于 疾病的诊断、预后和治疗。CD45RA CD45RO均为T细胞的辅助分子，CD45RA+， 纯真型T细胞当免疫力下降时减少；CD45RO记忆型T细胞对第二次抗原刺激 极其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中减少。方案（Protocol）同淋巴细胞亚群检测结果（Resul）HLA -B27 测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫荧光法。将 HLA-B27-FITC/ HLA-B7-P单克隆

17、抗体加入到全血中, 与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式 细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和 所占的百分比。标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1 .样本量1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在之间。若X109/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若vX109/l，应分离单个核细胞。4. 溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特1:单克隆抗体液体1ML28C(HLA-B27/HLA-B7同型对照lgG1/l

18、gG2a )2:全血溶血试剂液体A:甲酸液体70ML室温B:碳酸钠等液体32ML室温C:多聚甲醛液体14ML室温3:鞘液液体20L室温4:清洗液液体5L室温5:荧光微球液体10ML2-8 C成分质控品 BEKAMANCOULTE产品，未开瓶的试剂于2-8C保存，可在有效期内 保持稳定，稀释的试剂于2-8°C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时 进行校准。仪器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入 20 ul单克隆抗体和同型对照（IgG2a-FITC7 lgG1-PE）2）分别向试管中加入混匀的10

19、0u1抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血）b.使用COULTER PREP制备系统开机-显示READY丁亮-选择35SEC丁亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY丁亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）洗、离心、上机测样（备注：测B27 一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果报告阴阳性操作性能精密度批内五次重复CV<2%参考值阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在以上，阳性 率 >90%。临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短

20、臂上，该区 DNA片段长度约3000-4000KB 占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是 HLA-I类基因中B位点上的一个等位基 因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。HLA-B27基因属于？型MHC基因，所有有核细胞上均有表达，尤其是淋巴细胞表面含量丰富，人们 发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性， 超过90%的强直性脊 柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅 5-10%的认为阳性。由于强 直性脊柱炎症状与许多疾病相类似，临床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义，HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个 重要指

21、标。方案（Protocol）1选参数dIK； ffciomn sn； ffciomn sn：Pbn 比日护- ah声 ucmiH两耳ij«s=* = |BllniHd|1君EiJ£ 3g点击-ZyrBlS-山4«：啊 鸣 dClUR” r nirlId t v H ll-Zlb转< *! gKBLRijJ tl4r f's-jlr ?J< t'2 uirFfici h如砖弓护曲P"占林百丄直“XF世占时甘 m 怙 ruiHk rt£ F jt FU IftKCF.3c,*erfvn'i 氐F p联E <

22、C F NEM Hi 円 «FTbfCf m.t: UM81 0 gw33* dvS9U 匕.已L.LU厶日岭Jfab ET2Q n? n5SX* 二 签 d 丄 L &CLo:t(2:5 =S 5 V-5-JLhxp£z,s:B-h*t0*w-F =艮-H一Lb" >-!心&Fl*n:刁vu idijAKe ED1CV-tr 一 / dsoo* §Qi L£25$e61w4一 -a5-st3 - sMpa-2"爰 tl=KJ1JC9S41XFuu»j2'可”V*1(Aral?Hd±?

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24、 (+)2. n egative(-)I利 KA】 WIJMU FL I LgJFU LGlaJI aiftFt?0.5tt%二 2!-! l_ ,1:t' 1? h'r. I I I 'illC |I I 伸<D!勺1/B2TX-Mea n=X-Mea n=X-Mea n=CD55/CD59 测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对 PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞 （红细胞和白细胞）通过膜上的抗原分子与荧光素标记的 CD55

25、或 CD59的多克隆 抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求 1 .样本量1ml。2 样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用3. 溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特1:单克隆抗体液体1ML28C(CD59-FITC CD55-PE2:全血溶血试剂液体A:甲酸液体70ML室温B:碳酸钠等液体32ML室温C:多聚甲醛液体14ML室温3:鞘液液体20L室温4:清洗液液体5L室温5:荧光微球液体10ML2-8 C成分质控品 BEKAMANCOULTE产

26、品，未开瓶的试剂于2-8C保存，可在有效期内 保持稳定，稀释的试剂于2-8°C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时 进行校准。仪器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：（一）白细胞CD55/CD59检测1 准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。2. 溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血）b.使用COULTER PREP制备系统开机-显示READY丁亮-选择35SEC丁亮-开门-放入试管关门-自动进行溶 血-显示READY丁亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满

27、并能打出液体）3. 离心后分别加入CD55/CD59 10u和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4. 洗涤离心5. 上机测样匚）红细胞CD55/CD59检测1. 准备2支流式细胞仪专用管，分别标记2. 分别加入 CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。3. 向二管中加入1: 200稀释的样品100ul （可根据红细胞的数量调整），避 光20-30分钟。4. 洗涤离心。5. 混匀、上机测样。报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV<2%参考值CD55>97%CD59>97%PNH的临界值：RBC CD59>95%WBC CD59>90

28、%PNH的诊断值：RBC CD59>91%大部分>80%中性粒细胞CD59>84%临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如方案(Protocol )(同 HLA-B27)4#刪 if UfFlllnEl随 FLI 3Id1CM-FTC>|FU L他pq|FL"1叫j*1M结果:no rmallMOiRKH LEI Lin:abnormalIe血IS1I ip4Qart T干细胞检测和绝对计数方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与干

29、细胞 膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上 进行分析，从而得到百分数，加入 Flow-Cou nt即可得出绝对计数。标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1 .样本量1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3.样本白细胞计数应在之间。若X1O9/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X 109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌贝克曼库尔特剂型规格贮存成分1:单克隆抗体液体28C(CD34NO. IM1871CD45-PC5M2652Flow-Cou nt荧光微球2：全血溶血试剂（

30、Q-Prep）液体A:甲酸液体70ML室温B:碳酸钠等液体32ML室温C:多聚甲醛液体14ML室温(Optilyse C 液体室温3 :鞘液液体20L室温4:清洗液液体5L室温5:荧光微球液体10ML28C (Flow-Check)仪器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血）b.使用COULTER PREP制备系统开机-显示READY丁亮-选择35S

31、EC丁亮-开门-放入试管关门-自动进行溶 血-显示READY丁亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）需要做绝对计数时，在相应管中加入与血样等量的Flow-Cou nt（务必做到三同：同枪，同人，同种方法加 Flow-Count，而且加完即上机）6）上机测样报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度批内五次重复CV<2%参考值（百分数（绝对值）CD34+/CD45+ ± %临床意义目前把CD34作为造血干细胞的主要标志，CD34阳性细胞计数作为造血干细胞 水平定量的检测方法。方案（Protocol）同淋巴细胞亚群检测结果（R

32、esul）If hlH LIE" in白血病免疫分型测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与细胞膜 上或膜内相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞 仪上进行分析，从而得到百分数。标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位骨髓采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝要求1 .样本量1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在之间。若X1O9/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X 109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌贝克

33、曼库尔特剂型规格贮存成分1:单克隆抗体液体28C(CD34NO. IM1871CD45-PC5M2652Flow-Cou nt荧光微球2：全血溶血试剂（Q-Prep）液体A:甲酸液体70ML室温B:碳酸钠等液体32ML室温C:多聚甲醛液体14ML室温(Optilyse C 液体室温3 :鞘液液体20L室温4:清洗液液体5L室温5:荧光微球液体10ML28C (Flow-Check)仪器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作-样本制备：细胞膜表面抗原1 首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2 首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。3 然后，按

34、管上的标记，加入相应抗体各 10ul（注意：必须是FITC和PE标记 的抗体搭配）4. 各管中加入标本（骨髓或外周血）30100u1（根据细胞的多少决定），振荡混 匀，室温避光2030分钟。5. 溶血：a. OptiLyse C按说明书步骤溶血）b.使用COULTER PREP制备系统开机-显示READY丁亮-选择35SEC丁亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY丁亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）细胞浆和核抗原I. 准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2 .首先每管中加入标本（骨髓或外周血）100u

35、l（根据细胞的多少决定）， 5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3. 每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4. 各管中加入PBS4m。5. 300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。（1500r/min*5min）6. 各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。7 .加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避 光15分钟。8. 各管中加入4mlPBS振荡混匀。9. 300g离心5分钟后，弃去上清液。10. 各管中加入PBS500u（振荡混匀。II. 上机测样报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV<2%

36、参考值CD34+5%MPO+V5%粒系20% 淋系30%临床意义用于血液病的诊断和分型诊断方案（Protocol）方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在 PMA，Ionomycin和Monensin存在下短 期培养（辅助性T细胞通过细胞因子IFN-丫、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚 群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺 激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂 Monensin阻 止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量），然后进行细胞膜表面抗原和细胞

37、内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+H胞内的IFN- 丫和IL-4进行测定。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂肝素抗凝血要求1 .样本量至少1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在之间。若X109/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X109/l，应分离单个核细胞。4. 溶血样本不能用。试剂淋巴细胞培养体系伯配）成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 选白美国SIGMA公司。单克隆抗体（BeckmanCoulter公司）CD4-PC5 IL-4-PE IFN-丫 -FITC质控品 BE

38、KAMANCOULTE产品，未开瓶的试剂于2-8C保存，可在有效期内 保持稳定，稀释的试剂于2-8°C可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时 进行校准。仪器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作：细胞培养与染色取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMII640 洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5% CCb 37C孵育18小时，取出后以PBS 洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一 为测定管加入lOul抗人IL-4-PE和 IFN-丫 -FITC另一管加入同型对照，室温避 光2

39、0分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定打开流式细胞仪及氩激光光源（488nm）预热20min，同时仪器自动初始化； 用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测 50000 以上细胞，在前向散射光（FS和测向散射光（SSC散点图中圈定淋巴细胞群，然 后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和 IFN-丫 -FITC的表达。淋巴细胞在FS/SSC散点图中位置，即A门内细胞； A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞； B门内TH细胞亚群分布：1区数值-Th 1细胞 （）4区数值-Th 2细胞 （）2区数值-Th 0细胞 （）报告结果报告百分数操作性能精密度 批内五次重复CV<2

40、%正常参考值ThlQFN-丫 ）:± %Th2（IL-4）: ± %ThO丄土 %临床意义淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2, IL-12, IFN-y和TNF-b /a等，Th2细胞主要分泌IL-4. IL-5. IL-6, IFN-丫为Thl最特异分泌的细胞因 子, IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分 Thl 与Th2。Thl为IFN-丫十Th2为IL-4+。静息状态（人的正常生理状态、即未受到 任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的 Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的I

41、FN-丫和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中ThO即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-y和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测 Th细胞对刺激素刺激的反应能力。方案（Protocol）|Ugi因 1> U"l Llf!55 UH闻LUMCD fl-PCSAOmFLl- LoeJFLI gs-IM细胞周期分析方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：利用特殊的荧光染料（P、EB AO等）与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染 色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与 DNA含量成正比。流式细胞 仪

42、通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的 DNA含量标本采集与处理检测对象实体（肿瘤）组织、灌洗液、石蜡块、培养细胞要求 1 实体（肿瘤）组织、灌洗液和培养细胞如果不能立即做应用 冷乙醇固定，20C可保存2 3个月，70C可保存半年以上。2.样本计数应在x 106/ml贮存28 C试剂()(包括 DNA-Prep LPR和DNA-Prep 染料)2：鞘液液体20L室温3：清洗液液体5L室温4：荧光微球液体10ML28C (Flow-Check)品牌剂型 规格贝克曼库尔特成分 1: DNA-Prep试剂系统液体仪器Beckma nCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：灌洗液

43、或培养细胞PBS洗,稀释为x 106/ml,取 100ul,加入 DNA-Prep LPR 1秒后加入 DNA-Prep 染料1ml,室温避光15分钟。过300目滤网，上机检测。实体（肿瘤）组织单细胞悬液制备：将固定或新鲜的组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗， 直至将组织搓完为止。（如果是淋巴瘤只需用生理盐水冲即可）。将平皿中的 混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以 500- 800转离心 沉淀2分钟。染色：同上 上机检测 石蜡块 脱蜡水化：石蜡块切成50um厚，3-5片，放入二甲苯中室温放置24小时，

44、更换二甲苯室温再置24小时。取出加无水乙醇10分钟，依次加95%乙醇、 70%乙醇、50%乙醇及双蒸水各10分钟。单细胞悬液制备及染色：同上上机检测报告结果报告各期的百分数操作性能精密度批内五次重复CV<2%参考值临床意义DNA倍体分析用于肿瘤早期诊断、良恶性肿瘤判断、肿瘤预后、治疗方案的选 择，正常组织和良性肿瘤DNA均为二倍体，恶性肿瘤时则出现异倍体。nrrarr41W;朴辻亦W1<D3 1 ES 上I扣 *jMWN5出|FLU |J -1 S3d占_rusJlmLUJ B 空j a田事阳 Ml mT|iMriniXW*|鸥申呵g |豳ESQ |加号 5細*和”阿rjLELL

45、liMl 3=1护j屮心斫jINCDT J jf»R*T畔 j |Z许皿n护住 加lt|二：|彗E号翟1巨_阿1 k *H u '.丄 “-；"_| | ， IS I JH j.1: | *1 F * J -71 J t：* | krtg砒斗 J rtlW!5专F巴日尊IfFIHHJ兰_nJru_| -1_ZzlzidLlid0时55J fl钮rd S?T »iMN.FLE叫H叫a7Sg爭册Q申Z J 如 5 J3 J LEUn injpti 口 M 4 IPI Qij u.百a|_| Hapuy, M|awsfl'j|* 枫咛 存七 coj, p

46、 mu >nm =-气t包E1P ii 4 j h >i-i IE ; 1 .dl" ti * r - w：-；：wQB sr;"吕HjSjaiuejed 爭目ouoo JOgiuoMo 算联嫌誓联L(|OOOlOJd)尊RNErH二底ER-qn.ko.pt B EEftK-? E-Fr-IT片 n*-yls Qm-匕miikrTHIrbilhEH B口亍 sf42±ih»-Jsri 肚 fjpcjwifpikbg 甬-L-w塔审Kz>l盘'<I-T聲Lp 机LiK <£*T"N)1函LLrpr*tLlnwfKtsso-3rl?K i-B-Q替 CUTEST 烷虫a口InertPJ- Tnwi 7115呂UL片 LdMf bFF s5 ？ 克FBIUJfRanb叵.杀:?.辛i-3a叵 4匾亠書军申壬-=vcl&屛舄P 一 if 叫 F 才|=1-Fmr? Canp q .LLALr.F 护 FUI* | H L'.l*F V F U 也 I：WE £7-ylAInf r 工Ileses If LlFt- tn(A)f L3 UrvUHFlil LI4结果（Resul）血小板膜表面抗体测定方法流式细胞仪（Bec