肝糖原的提取、鉴定与定量-第七实验室

1、肝糖原的提取、鉴定与定量-第 七实验室 南施耿学 生物化学实验报告 姓 名： _ 学 号： _ 专业年级： 组 别： _ 生物化学与分子生物学实验教学中心 指导老师格式要求： 正文请统一用： 小四号，宋体， 1.5倍行距；数字、英文用 Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用 蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。 一、 实验目的 1、 学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法； 2、 学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法； 3、 学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式； 4、 正确掌握使用离心机的方法步骤； 5、 熟练运用溶液混匀的各种

2、方法； 6、 正确掌握溶液转移的操作； 7、 正确掌握使用分光光度计的方法步骤 二、 实验原理 实验 1 肝糖原的提取与鉴定 糖原是生物的主要储能物质之一， 主要储存与肝细胞中， 采用研磨匀浆等方法可以使肝 细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝 组织中的酶并且使蛋白质沉淀， 糖原则能够稳定地保存在上清液中， 从而达到分离糖原 与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用 滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中 葡萄实验名称 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 实验日期 实验地点 合作者 评分 教师

3、签名 批改日期 95%乙醇将 糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。此外，糖原还可 以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。 糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热 2min后会出现砖红色沉淀。 CuS04 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(0H)2 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖+ H2O 2CuOH = H20 + Cu2Ct (红色) Cu(OH)2 = H2C + Cu( (X (黑色) 实验 2 肝糖原定量测定 糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成

4、分，保留 肝糖原。糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成 5-羟甲基 呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在 620nm 处有最 大吸收。糖含量在10-100yg溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。 利用该反应原 理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。 三、材料与方法：以流程图示意 1、实验材料 (1)肝糖原的提取与鉴定 样品：1.50g的鸡肝 试剂：5%三氯醋酸溶液、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaCH溶液、碘试剂 和班氏试剂 仪器和器材：离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温 -100 C恒温水浴

5、箱、剪刀、镊子、刻度吸管、加样枪和白瓷反应板 (2)肝糖原的定量测定 样品：0.15g的鸡肝 试剂：30%KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和 0.2%蒽酮溶液显色剂 仪器和器材：室温-100C恒温水浴箱、比色皿、100ml容量瓶、分光光度计、试管、剪 刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪 3、实验步骤与方法 (1)肝糖原的提取与鉴定： 鸡肝约 I +1m1ml 5%5%三氯醋 全部转入离心 - +3ml 管中，离心 +2m+2ml 95% 95% 乙醇， 糖原溶 m 瓷板 +50%NaOH 糖原水 I I 糖原水 + +班氏试 图一：肝糖原的提取与鉴定实验流程 (2)肝糖原定量测定 鸡肝 0.15

6、 g， 沸水浴15分钟 冷却，全 部转入 图二：肝糖原定量测定试验流程 加水至标 线，仔细 取3支试管，按下表操作。 试剂（ml） 空白管 标准管 样品管 蒸馏水 1.0 标准匍萄糖溶液 1.0 _ 糖原提取液 1.0 0.2%蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5 表一：糖原测定试管操作 混匀，沸水浴10分钟，冷却至室温。在分光光度计620 nm波长处，用空白管溶液调零, 测定各管溶液的吸光度（A）。 四、结果与讨论： 结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑 推论，并得出结论。 1、实验现象 实验一：肝糖原的提取与鉴定 所获糖原溶液如下图: 所获糖原溶液呈乳样光泽将糖原溶液滴到碘试剂

7、中可以勉强看到溶液出现浑浊, 砖红色沉淀不明显，说明样品 糖原水解液与班氏试剂混合后溶液变深蓝。沸水浴加热 2min后，产生浑浊，砖红色 鸡肝中糖原含量少 图四：糖原溶液与碘试剂反应 沉淀不明显，说明样品鸡肝中糖原含量少 图五：糖原水解液与班氏试剂混合沸水浴后 实验二：肝糖原的定量测定 图六：加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比 2、吸光度数据记录: 620nm波长吸收度值记录 测定次数 - 各管吸光度值A620 空白管 标准管 样品管 1 0 0.672 0.099 2 0 0.671 0.101 3 0 0.672 0.102 各管平均值 0 0.672 0.1

8、01 表二：620nm波长吸收度值记录表 3、结果计算: A样品过 og 100 根据公式：肝糖原（g/100g肝组织）=A标准 肝组织重（g） 计算结果得样品肝糖原（g/100g肝组织）=0.56g/100g肝组织 故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝糖原，且肝糖原含量为 0.56g/100g肝组织 4、结果分析 100 1000 1. 11 空白管、标准管和样品管混匀呈现如下颜色反应 经查阅资料得：饱食鸡肝的肝糖原含量为：23g/100g肝组织，而本次实验测得肝糖原 =0.56g/100g肝组织，即本次实验测得的肝糖原含量偏低。 5、 讨论总结 （ 1 ）与碘试剂反应时：加入糖原的孔穴并没有

9、出现预期的明显红棕色。究其原因，在 取糖原沉淀时，沉淀很少，糖原含量也很少。而又因为碘试剂本身是黄色的，本来现象 就不是很明显，这样一来，几乎看不到反应会产生的红棕色了，说明糖原含量极少。 （2）糖原中葡萄糖的鉴定： 实验结果也没有如预期中的蓝色溶液沸水浴后变为砖红色。 原因还是糖原含量极少，又加过少量酸与碱，浓度更小，现象更不明显，所以观察不到 明显的砖红色。 （3） 在肝糖原定量测定中，三只试管水浴 15min后，标准管颜色最为明显，为绿色， 加入的是标准葡萄糖溶液，样品管与空白管颜色依次递减。 （4） 由资料可知饱食鸡肝糖原含量宜在 23g/100g肝组织，而本次实验测得肝糖原为 0.56g/100g肝组织，偏低。究其原因，实验中操作没有失误，与其他小组和其他实验室 对比，发现各小组结果均偏低， 可以推测，实验现象不明显原因是鸡肝材料糖原含量偏 低。 6、 结论：本次试验为肝糖原的提取、鉴定与定量 ，通过这次实验掌握了组织样品的