用QuantityOne进行定量分析的方法

1、用Quantity One进行定量分析的方法 生物技术 2009-09-06, 21:17 叶林Quantity One是Bio-Rad公司的凝胶电泳图像获取、处理以及定量分析软件。功能很强大，到底多么强大在这就不 说了。用处很多，到底多么多在这也不说了，具体功能请参考 Quantity One使用说明及相关教程。 下面只是QuantityOne用于DGGE结果定量分析的一般操作方法：有下面这么一张 DGGE图像，需要分析一下左边第 5条泳道的8个条带对应的DNA在样品中占的百分比各分别是多 少。第一步：建立泳道点击菜单栏"LaneAuto Frame Lanes ” 一般情况下Qu

2、antity One会自动识别并建立泳道。但也有很多时候不能自动建立泳道，这就需要选择菜单栏“LaneFrame Lan es'然后输入要建立泳道的数目，手动建立泳道。泳道建立后需要调整，在菜单栏“LanEdit Frame '中有拉伸、旋转、移动、添加/删除锚点等选项，通过这些选项可以对泳道进行调整， 调整后大致如下：www.yelinsiky wm第二步：消除泳道背景点击菜单栏"Lane_ane Background跳出一个对话框， “All Lane曲选择第二个，然后点一下第5条泳道，“SelectedLane的下面会显示 Selected La n: #5(#

3、5)，然后选择选Lane On “ Rolli ng Disk S中填一个1020之间的数(可以多尝试 几个，看看效果)，最后点“Done完成操作。第三步：建立条带点击菜单栏 “ Band>Detect Bands打开一个对话框，调整Sensitivity和Lane Width的数值，使每个条带都被检测到， 如果条带上面显示的是一条红线，可以在“BancBand Attributes的Style栏中选择 Brackets使之显示为括号形式。条带建立后图像显示如下：WWW yllnsky corn第四步：生成报告点击菜单栏 “ReportLane Report '然后点一下第五条泳

4、道， 在弹出的对话框的 Measurements 栏中选择 Trace Qty （个 人感觉选择这个比较合适，也可以选择其他的看看效果），然后点Report，就看到了每个条带的 Trace Qty值，这个值与DNA的浓度呈正比，根据这个值计算百分比即可。以上仅仅是Quantity One进行定量的简单流程，非常不具体，一些具体的参数设置及软件的其它功能请参考相关的 使用说明或教程。另外，不确定上面的操作是否有不当之处，如有请多指教。需要特别说明的一点是：对于一个从复杂的环境样品中提取的DNA，经过PCR-DGGE然后用Quantity One定量，通过分析每条条带的intensity来计算百分

5、比，然后估计原始样品中各个物种（比如细菌）的百分比，这样的做法是 非常不准确的，这种数据发paper可能不会被接受，因为整个过程中存在很多Bias。同理，T-RFLP也存在类似问题。Quantity One施用教程大全（转贴） 2010-11-11 09:531 -内容简介凝胶电泳是每个做份子有生命的物质学的同窗天天都要打交道的基本技术。电泳然后的信息处理与电泳本身同样重要。今朝有大量软件可以用于分析电泳结果，比较有名的比如Ban dScanBandLeader、Sigma Gel等等。今日要向大家介绍的是来自 Bio-Rad的1D凝胶定量软件 Quantity One （Bio-Rad还有一

6、个做2D凝胶分析的软件PDQues）。这个软件的最新版本可以在 Bio-Rad的主页不 收费下载。今朝的最新版本是4.52版2 - Qua ntity One的定量方法Quantity One的分析功能顾名思义首要用来举行凝胶或培养皿的荧光定量分析。它的分析功能 或说分析方式首要有4种：泳道/条带轨迹定量法；等高线直接定量法；菌落计数；份子量测定这三种方法中施用最为利便也是最为广泛的应该是等高线定量法（Volum nCon tour ）。它经由过程半AUTO苗绘电泳条带的等高线边沿来得到等高线区域内部平面或物体表面的大，再将该平面或物 体表面的大乘以区域内平均光疏密程度值当到条带内部总的信号量

7、。固然这种分析方法的蠹弊显而易见：无法同等得排除不同泳道的配景亮度；等高线的绘制处于“半AUT O状态，即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边沿；最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时辰几乎无法绘制纯一 条带的轮廓（常出现持续的几个条带等高线相连而无法分离出独自条带的轮廓）。三种方法中个人感觉最为科学和严谨的应该是泳道 /条带轨迹定量法（Trace Tracking ）。这种 方法施用起来步调较为繁琐，必需经由过程泳道识别-电泳条带识别两个持续的步调才气举行定量。 然而这种方式的最大长处在于它可以纯粹丢弃人为主观因素举行全AUTO定量。他的定量方式为：首先根据不同电泳条带的光疏密程度值绘

8、制光疏密程度曲线，然后计算光疏密程度曲线下平面或物体表面的大作为电泳条带的定量根据。 大家可能会问他能不能排除泳道配景？谜底是必定的，它能够最大程度的排除不同泳道之间的配景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎不异的开始跑线上举 行相比较。这个配景排除功能是等高线法无法做到的（等高线法也有基本的配景排除措施，但是和泳 道/条带轨迹定量法的配景排除不是一个等级的。等高线法只能排除同一泳道上的配景，而不能均等的排除不同泳道的配景)。另外泳道 / 条带轨迹定量法还可以联合 Gauss Model Bands 对紧密相连的 电泳条带举行分析，而这种条带也是等高线法无法分析的。我们这次重点学习这个方

9、法。第三个分析功能是菌落计数( Colony Counting )。这个功能其实很实用，可以分析蓝白筛选的 结果。但是很奇怪 My computer 居然无法运行这个功能， 因此无法向大家介绍了。另外 Quantity One 还可以经由过程回归曲线测定份子量。下面让我们了解一下 Quantity One 经常使用的基本菜谱操作。打开文件：由于 Quantity One 是 Bio-Rad 的硬件组成一套软件，因此 Quantity One 可以 AUTO 输入来自 Bio-Rad 公司的凝胶分析仪的数据。具体支持哪些硬件大家可以在“Edit -Preference- Imagers ”里面设

10、置。如果您的实验室没有接纳 Bio-Rad 的硬件设施也没瓜葛。 您只要将电泳图片用ACDSe等程序转换为TIF图片格式就能够被Quantity One识别了。注重 Quantity One 只支持 8 位和 16位灰度的 TIF 文件。Quantity One彷佛有一个小bug,就是在按“ Ope6然后并没有立刻弹出资源管理器让你选择方 针文件的位置。其实你只要将鼠标在荧幕右下方点击一下，资源管理器就会乖乖弹出来了 .Quantity One只能分析白的颜色配景 玄色条带的电泳图。而我们正常环境下得到的一般都是玄 色配景 白的颜色条带的电泳图。我们可以在“ Image-Invert data

11、 中将图片颜色举行反转,然后即 可以用 Quantity One 举行分析了 .文字注解： Quantity One 提供基本的文字注解功能。您可以在您的电泳图片上记载您的分析结 果比如电泳条带的份子量、光疏密程度值、事物的量等等。这个功能可以经由过程“ Edit -Text Overlay Tools ”来使成为事实。在弹出的浮动工具栏入选择“ ABC或“”就能够举行文字输入和画 标志线的操作。光疏密程度工具：在“ View-Plot Density ”的下级菜谱中大家会见到几个和电泳条带光疏密程 度值相干的预示选项。 大家可以别离选择不同的选项感受一下它们之间的不同。 选择方法是点击响应

12、的下级菜谱比如“ Plot Cross Section ”,然后将变成带一个蓝色感慨号的鼠标移到您想懂得光疏密 程度的位置, 点击一下就会预示该处的光疏密程度相干信息。 鄙人面这幅图片中我们可以看见两条黄 线交叉处的电泳条带的相干信息。 上方的一串曲线是不同泳道之间在同一平行线上的光疏密程度比率 曲线；左边是黄线交叉处地点泳道的几个电泳条带的光疏密程度漫衍环境。3D Viewer :在“ View-3D Viewer ”菜谱中大家会看到一个有趣的功能叫做3D Viewer。这个玩意按照 Bio-Rad 的说法可以辅助鉴别几条紧密相连在一路的电泳条带的漫衍环境。 大家只要选择了这 个号令后鼠标就

13、会一个“ ”型,然后将 型移动到您感兴趣的位置,拖动鼠标画出一个正方形区域, 然后用鼠标双击, Quantity One 就会将这块区域按照 gauss 漫衍规律渲染成一个三维模子,颇有意 思。但个人感觉这个功能噱头多于实用。4 - Quantity One 的基本配景排除功能最起头的时辰我们就说过 Quantity One 的等高线定量模式也有一种比较基本的配景排除方法。 这个方法同样也合用于泳道 / 条带定量模式。此刻我们就来学习这个方法。基本配景排除的功能位于“Image- Substract backgroud.”和“ Image Filter Wizard. ” 这两个菜谱。Imag

14、e-Filter Wizard ：这个功能是对原始图片做一些开真个加工， 主如果祛除一些图片上的“斑 点”。这些斑点首要有两种类型： 一种是深色的“胡椒面”型和淡色的“食盐”型， 两种斑点都可以 毫不犹豫地去除。从“ Image-Filter Wizard. ”菜谱调出向导菜谱后选择“ pepper ”和“ salt ”， 下面两个选项可以按照程序默许的选项，然后“0K就能够完成这第一步的降噪历程。Image-Substract backgroud ：这个功能是真正对图片配景举行清理的工具（区别于 “Image-Filter Wizard. ”的降噪模式）。只是这种清理是一种“全局”型的清理，

15、即它以不异的 参量对每条泳道举行配景清理。然而在清理方式上它照旧可以分成两种不同的方式：Backgroud Box ：一种是以一个局部小平面或物体表面的大为标准配景，将整张电泳图片上所有 比该区域光疏密程度值低的区域全部漂白。这种发型称为“ Backgroud Box” 。操作时用鼠标选中对 话框下部左侧的“ Backgroud Box ”按键，然后用鼠标在电泳图片上选择一块颜色近乎配景色，色泽 比较匀称的区域， 用鼠标拖动画出一个正方形。 开释鼠标后程序就会当即对电泳图片举行降低配景的 处理；Backgroud Stripe :相对于“ Backgroud Box”来讲是一种更加智能化的处理

16、方式。它出格合用 于梯度凝胶， 即凝胶浓度由上至下依次变化。 由于梯度胶的光疏密程度值在一定距离内不断变化， 因 此如果接纳“ Backgroud Box”的方法除配景就会发生偏差。Quantity One此时提供一种随着凝胶浓 度变化而变化的除配景方式就是“ Backgroud Stripe ”。和“ Backgroud Box ”近似，选择右下角的 “Backgroud Stripe ”按键，然后用鼠标沿着电泳泳道拖放形成一个狭长的剪影带（ Stripe ），这个 剪影带内部的光疏密程度值顺着泳道逐渐升高或降低。Quantity One根据这个Stripe可以动态的对整张图片的配景举行剪影

17、。比如泳道肇始处光疏密程度低，那末 Quantity One 在此处的剪影值也降 低；随着Stripe向前延长，光疏密程度值逐渐升高，Quantity One也同样不断加大剪影的强度。这 样一来就能够排除由于梯度胶带来的配景不相符的影响因素。5 - Quantity One 的电泳泳道分析功能 - 创建泳道前面说过Quantity One之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法。此刻我们就来学习一 下如安在电泳图片上创建泳道（Lane）和怎样举行针对不同泳道的配景排除。创建泳道: 首先打开我们要分析的电泳图片 （以卵白质电泳为例） 。然后选择“ Lane-Auto Frame lanes

18、”。这时候如果您的电泳图片比较标准的话，Quantity One就会AUTO识别出每条电泳泳道的位置，而且将各个泳道的路径用一条红线标画出来；如果您对软件AUTO标志的泳道不甚对劲，您可以经由过程“ Lan&Edit Frame"下级各个子菜谱 提供的功能对泳道框架位置、 大小等举行调节。 调节方法就是经由过程鼠标的拖放来使成为事实， 大 家可以本身体验一下；如果您只消分析此中几个泳道的数据而不想其它泳道的标志滋扰您的眼看东西假想线， 您可以经 由过程“ Lane-Single Lane- Remove Lan6'删除您不需要的泳道的标志。不是所有的电泳图片的泳道都能

19、够被 Quantity OneAUTO识别。在不能AUTOS别的环境下,Quantity One 就会弹出对话框告诉您它不能识别泳道。这时候大家就需要手工绘制电泳泳道。方法 和上边同样，同过“ Lane-Single Lane- Creat Lane ”来使成为事实。只要用鼠标在您的电泳图片上 顺着待标志的泳道的中轴线拖放就能够绘制出该泳道的标志红线 .6 - Quantity One 的电泳泳道分析功能 - 排除配景前面说过Quantity One之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法。此刻我们就来学习一 下如安在电泳图片上创建泳道（Lane）和怎样举行针对不同泳道的配景排除。排除配景

20、：首先请大家注重，这个排除配景和前面我们在“Image”菜谱中施用的“ SubstructBackgroud ”有所不同。后者排除配景的对象是全般电泳图片而非将各个电泳泳道的配景别离举行排 除。此刻我们要学习的这个号令可以帮忙我们别离排除各个泳道 （也能够将全部泳道用不异标准举行 排除）的不同的光疏密程度配景。这个功能对我们以后的分析影响甚大，大家一定好好学习。首先我们要将我们的电泳图片举行前面谈到的泳道识别，不论是AUTC方式照旧手工识别。然后选择“ Lane-Lane Backgroud. ”号令。选择该号令后，鼠标即变成一个绿颜色的“ ”，将鼠标移 到您筹算举行配景排除的泳道（比如下图中

21、的第 4 泳道），点击左键一下，立刻就会弹出如下图所示 的对话框。此中“ Optical Den sity ”预示得是该泳道光疏密程度值的漫衍环境。大家会注重到这个漫衍曲 线其实不是紧贴着纵轴， 而是位于纵轴上方漫衍。 造成这个“悬在空中现象”的缘故原由就是该泳道 自身存在着一定的光疏密程度“配景”。 这个配景的存在导致该泳道上各个电泳条带之间不能处于同 一水平举行相比较；如果思量到相邻的其它泳道更是因为不同配景的存在而无法相比较不同泳道上的 不同电泳条带。怎样去除这个配景呢？我们继续看右面的“ Lane Backgroud Substruction ”对话框。 这个对话框的上方“ All L

22、anes”表示可以对所有泳道举行一次性处理；下方的“ Selected Lane”表 示仅针对这次选中的这个泳道举行处理 （我们选中的是第 4泳道）。我们用鼠标选择“ Selected Lane” 的“ La ne On”选项。然后鄙人面的“ Rolli ng Disk Size”里填上“ 5”，再按“回车”键。好！大家再来看看此刻“ Optical Density ”中出现了一条紧紧沿着光疏密程度曲线漫衍的深赭色曲线。这 条曲线将泳道的配景与电泳条带的光疏密程度漫衍十分精确的区分清楚隔来。大家可能会好奇这搭的“ Rolli ng Disk Size ”指得是啥子意思？我们可以将 Qua nt

23、ity One提供 的去除配景功能想象成是一个骨碌的小球。 如果这个小球的半径越小， 那末它沿着光疏密程度曲线骨 碌时滚过的路径就越发精致， 具体反映在深赭色曲线的轨迹越发靠近玄带颜色的光疏密程度漫衍曲线 的基线。因此从理论上来讲“ Rolling Disk Size ”的取值越小，它的去除配景效果越好。大家可以 试着选择一个较大的值比如 80，再来看看此时深赭色曲线的轨迹。固然也不能取过小的值。因为如 果取值过小， 大家可以想象这个十分微小的球就会滚入光疏密程度曲线内部， 造成有用阳性信号的损 失。个人感觉 520是一个比较好的取值范围 .OK 我们再在“ Lane Backgroud Su

24、bstruction ”对话框的最下方钩选“ Show Lane Trace withBackgroud Substructed ”，再来看看是否泳道上所有的配景都被消弭了？各个电泳条带是否纯粹联 合到纵轴上在同一水平举行比较了？我们对其它泳道也能够依葫芦画瓢举行近是的配景排除工作。如果大家觉得可以施用同样的标 准，即不异的“ Rolling Disk Size ”举行排除，那末我们可以在“ Lane Backgroud Substruction 对话框入选择上方的“ All Lanes On（same level） ”选项。然后在“ Rolling Disk Size ”中填上 个合适的值，

25、点击“ Do nd'按键确认就能够了。此时该电泳图片上所有的泳道都以不异的标准举行了 配景去除。不信你可以本身将鼠标点击其它泳道（比如第 8 道或第 1道），你会发明所有泳道的配景 均已去除。7 - Quantity One 的电泳泳道分析功能 - 相比较泳道刚才我们已经对电泳图片上的泳道举行了识别和配景去除。此刻我们可以利用Quantity One 提供的泳道相比较功能对同一张凝胶相片上的不同泳道举行相比较， 看看每条泳道上电泳条带的漫衍环 境。泳道相比较：首先将打开的电泳相片举行前面谈到的泳道识别和去除配景步调。然后选择“Lan&CompareLanes”号令，鼠标变成“蓝

26、色感慨号”然后将鼠标移动到您但愿举行相比较的泳道 上（比如下图的第3泳道），左键点击，Quantity One就会立刻探出一张玄色配景的“ CompareLanes” 对话框。在这个对话框中红色的曲线代表您选择的泳道的光疏密程度漫衍曲线。 曲线的波峰部门表示 位于泳道上的不同电泳条带； 波峰的凹凸象征电泳条带光疏密程度值的大小； 波峰的宽窄象征电泳条 带的宽度；波峰由左至右表示各个电泳条带顺着泳道由后向前的漫衍。大家请注重这个红色曲线。 它不仅只提供给我们关于泳道上光疏密程度的漫衍环境， 更重要的是 鄙人一步我们对电泳条带举行定量的时辰， 我们将以每个波峰的曲线下平面或物体表面的大作为定量 的

27、标准.我们还可以用鼠标点击其它我们感兴趣的泳道（比如下图中第六、9、14 泳道），这时候再转到“CompareLanes”对话框我们会发明Quantity One已经帮我们用不同颜色在同一张图片上绘制出了 这 4 条泳道的相比较图。是不久短常 PP？8 - Quantity One 的电泳条带分析功能 - 创建条带前面我们已经识别和分析了电泳图片的泳道， 下面我们起头研究电泳条带的问题。 首先在这搭明 确两个名词翻译：“La ne”指电泳泳道；“ Band'指电泳条带。鄙人类社会文化中一例施用这两个英 文名词来表示这两个意思。电泳条带的识别：和前面研究 Lane同样，首先我们要对Lan

28、e上的Band举行识别。识别方式同 样分为AUTO识别和人工识别。AUTOR别的时辰选择“ Ba nd Detect Ban ds. ”号令。这时候Qua ntity One会AUTO单出一个“ Detect Ba nds ”的对话框（如下图）。首届用Qua ntity One的朋友可能会发明您的Ba nds识别以后仅只是画出了一条红色的粗线，而 在上边的演习图片中倒是上下括号的形式。其实大家可以在“ Band-Band Attributes ”选项中设置 Bands的预示形式。鄙人方的“ Style ”选项卡入选择“ Brackets ”就会将原来的粗线改为括号形式 了.在上边的对话框中，我

29、们可以指定识别的参量。如果要AUTC识别所有Lanes上的Ba nds就钩选La nds后面的“ All ”选项；如果仅只想 AUTOR 别某一条Lane上的Bands就钩选“ On6'，然后在后面的输入框中填上您想识别的泳道号码；如果仅只想识别泳道上部门光疏密程度值最强的Ba nds,可以在“ Bands”后面的选项入选择“Limit ”，然后填上响应的数目（比如10）。Quantity One就会仅识别该泳道上光疏密程度最大的 10条 Bands；如果您发明AUTO识别的Ba nds宽度太窄，圈定Band的红色括号内范围小于玄色的光疏密程度影。 此时可以施用“ Lane Width

30、”号令来调整Bands识别的宽度。用鼠标点击“ Lane Width”后面的向上 箭头就会发明红色括号逐渐变宽，最后要求其范围略为宽过其包绕的Band影迹；如果您发明AUTC识别功能没有识别您想要的 Band或误识别了您不想要的Ba nd,您还可以施用 上边的工具栏举行调整。将您的鼠标指向每个图标，Quantity One就会懂得弹出一个*的提示信息告诉您这个按键的功能。在此再也不继续阐述了。9 - Quantity One 的电泳条带分析功能 - 高斯建模与结果分析此刻我们已经完成为了泳道识别、配景去除、条带识别的任务。接下来我们要对Bands举行一些处理，然后就能够举行最终的结果分析了。高

31、斯建模：大家学过计数学知识后都懂得高斯（Gauss）漫衍是个啥子意思，在此我就未几作解 释了。Qua ntity One认为一个理想状态的Ba nd内部的光疏密程度漫衍应该也服从高斯曲线的特性， 正如前面向大家展示的 3D Viewer 中的图片那样。 在我们同样平常的电泳泳道中时常出现几个相隔很 近的Ba nds （即份子量很接近的几个卵白或核酸）在泳道的某个区域成串出现。此时我们很难经由过 程会自等高线的措施精确的描绘出每条 Band自力的轮廓。这个时辰我们就需要对这些拥挤在一路的 Bands举行高斯建模处理。Quantity One能够依据高斯曲线的特性，配合有用的配景去除，将各条紧 靠

32、在一路、界限彼此融合的Bands描绘成具有自力光疏密程度漫衍的彼此叠合的曲线。如下图所示， 原来彼此融合的22、23两条Ba nds经过高斯建模然后变成为了两个具有自力漫衍曲线，彼此叠合的 Bands。高斯建模必需建立在有用的泳道配景去除然后。 配景去除的方法可以参见我们前面的方法， 即经 由过程“ Lan e- La ne Backgrouds ”的方式举行去除配景。去除配景的时辰最佳选择 Rolli ng Disk Size 小一些的方案。这样配景去除后的光疏密程度漫衍曲线和高斯建模后的光疏密程度漫衍曲线才气比较 好的吻合。另外高斯建模其实不是一个必需的步调。它仅只在出现多条Bands紧密

33、摆列在一路，以至 于无法分辩它们之间的间隔的时辰才最有用。如果Bands在泳道上松散的漫衍则可以不施用高斯建模.那末怎样举行高斯建模呢？很简单！只要执行“ Band-Gauss Model Bands. ”号令就能够，执 行后Quantity One回弹出一个对话框问您要对那条泳道举行高斯建模。请钩选“ On6'，然后再输入 需要建模的泳道代码就能够了（比如下图中的第 2泳道）；如果选择了“ All ”则对所有泳道举行高 斯建模，固然建模这么多泳道会费一点儿时间了。察看结果：执行完高斯建模以后施用“ Band-Band Information ”号令来察看结果。方法是将变 成蓝色惊叹号

34、的鼠标移到刚才已经识别的Band的部位，一个详细的“ Bandin formation ”信息框就会立刻弹出来（见下图）。在这幅图中我们必需注重的是“Trace ”和/或“ Gauss Model Trace ，因为我们刚才辛苦了半天就是为了得到这个数据。这个数据表示的就是Band光疏密程度漫衍曲线下平面或物体表面的大，也就是 Quantity One用来表达Band内份子总量的方式。在这个信息框中还有 一些重要信息比如“ Mol Wt” （份子量）；“ Quantity/Units ”等此刻照旧空缺，咱们下以后的分析 步调中将逐渐填满它们。Quantity One有一点儿让人感到很半大白。它

35、的“ Trace ”和“ Gauss Model Trace ”都是表示 曲线下平面或物体表面的大的，可是施用的单元是 OD*mm而在另外的等高线定量方法中，同样是表 示某个区域平面或物体表面的大的单元倒是 OD*mm2.下面让我们回过甚来看看高斯建模然后电泳图片的分析结果到尽头发生了啥子变化。 首先是一张 没有举行高斯建模的图片，大家可以看到在这张图片中的白框部门，第2泳道的第6个band的光疏密程度曲线*部门其实不呈高斯对称（少了一部门不是？）。这是因为它一部门和邻近的Band彼此融 合在一路了。此刻再来相比较一下经过高斯建模后的电泳图片分析结果。照旧在不异位置，这时候代表第 2 泳道第6

36、个Band的*光疏密程度曲线是否呈完备的高斯对称了？而且后面的“ Gauss Model Trace ” 也再也不是“ N.A”，而变成为了“ 0.717 OD”，相比较上边的“ Trace” =0.693 OD,大家想想为啥 子要大一些呢？！10 - Quantity One 的电泳条带分析功能 - 份子量预先推测前面我们和大家学习了用 Quantity One 举行电泳条带定量的基本方法。此刻我们暂时转移眼看 东西假想线来探讨一下另外一个功能，份子量预先推测。这个功能对卵白质而言是份子量预先推测， 对核酸而言就是核酸大小的预先推测了。下面我们照旧以卵白质为例来学习。份子量预先推测：首先大家

37、必需懂得的是份子量的预先推测是建立在泳道和条带都已经创建好的 根蒂根基上。 我们只是人为的为一些泳道上的条带加上一个已知的标准， 然后经由过程不同泳道和条 带之间的相比较绘制回归曲线，经由过程回归曲线的走历来预先推测特别指定条带上的份子的份子 量。固然如果我们能够在一次电泳中多跑几条不同份子量身分的marker，肯定是能够提高我们预先推测的准确性。下面我们谈谈怎样操作。在已经创建好泳道和条带的图片上， 执行“ Match-Standard ”号令，在 弹出的“ Select Standards ”选项卡入选择一个合适的 marker。如果您本身已经跑了 Marker，那末 请选择“ New S

38、tandard”创建您本身的marker，然后在弹出的“ Standard ”菜谱中输入您的 Marker 的份子量。如下图在“ Standard ”中输入一个名称，然后鄙人面的表格中输入各个 Marker的份子量 和名称。输入完成以后用鼠标点击“ Type”下面的小箭头（上图鼠标指向的位置），然后把变成绿颜色加 号的鼠标移动到您的 Marker泳道上响应的ba nd。例如上图中200KD就移动到第15泳道的200KD的 位置，以此类推，将每个 Marker都标志上响应的数字。标志完成后， Maker泳道上的Ba nds就会变 成蓝色。如果您有多条 Marker 泳道，您可以再多表记几条以提高

39、软件预先推测的准确性。此刻我们执行 “Match-Standard Curve ”，然后用鼠标随便点击我们想要了解的泳道， Quantity One 立刻就会为 我们预示出一条曲线，当中还有一个小的对话框“ Std.Curve Options for Proteins ”，在这个对话 框中“ Regression Model ” 选择“ Point to Point Semi -log ”或“ Elder - Southern ” 这两种回归方 式；然后钩选当中的“ Show Numerical data of Points ”，这时候再看那条曲线上是否已经标注了 很多数字？这些数字就是水平方

40、向上对应的Ba nds的份子量了。上边说明说过，在 Band Information 中除了“ trace ”和“ gauss model trace ”之外我们还有 几个项目没有填入数据。这些其时未填入的数据其实是“ Mol.wt ”和“ Quantity/Unit ”这 2 项。刚 才我们已经学习了怎样预先推测份子量，大家此刻再用“ Band- Band Information ”号令看看您感兴 趣的Ba nd,是否“ Mol.wt ”已经被填上数字了？此刻只剩下“ Qua ntity/U nit ”，让我们起头学习怎 样测定具体的定量值（原来测定的仅只是光疏密程度值和Band之间的事物的

41、量的比，而没有落实到具体的实际数字）。创建定量标准：所谓创建“定量标准”其实近似于刚才我们设置的份子量Marker。只不外这搭我们用已知Band的事物的量做为Marker，就像用5ul的DL2000跑电泳，每条Band含50ng的双链 DNA 具体操作如下：执行“ Analysis - Quantity Standards ”，在弹出的“ Calibration Curve”对话框入选择“ Creat New”，在随后的“ Quantity Standards ”对话框中填写一系列相干信息。重要 的信息包孕：ng，ug，mg等等。1. “Units ”：指作为 marker 的事物的量的单元，

42、例如2.Measure”：指对Maker和待测Band的丈量方式。点击“ Measure”按键后可以选择“ TraceDensity ”、“ Contour Density ”、“ Peak Density ”和“ Average Density ”。如果您前面的分析 接纳的是轨迹法定量的话可以选择“ Trace Density ”；如果您接纳的是等高线法定量可以接纳 “Contour Density ”。3. “ Select ” ：在“ Select ”后面有三个选项，Ba nd Match、Lane。选中此中一个选项比如“ band”，然后将变成向上小箭头的鼠标指向您本身跑的Marker条带，点击左键，就会发明此时该Band已经变成*。您可以多点选几个作为 Marker的Band（至少3个，越多越好），然后回到“ Quantity Standards ”框。这时候框下部的表格变成可填写状态，在“Quantity ug”中填入响应的数字，每个数字对应您刚才标志的作 marker的Band&后面的“ Dilution factor”项可暂时不管；其它两项“La ne”和“ Match ”首要用来一次性填入一