生物工程设备综合实验指导定稿

1、生物工程设备综合实验指导讲义实验名称：生物反应器使用及酵母培养1. 实验目的本课程是配合生物工程设备课程教学设置的独立实践环节，通过实验，使学 牛加深对牛物工程设备所学知识的理解，进一步使学牛掌握牛物工程企业的设备 流程、设备结构及工作原理，了解设备的安装与维护。通过本课程的学习，使学 牛初步具有独立分析和解决牛产及试验研究中工程设备问题的能力。2. 实验原理生物反应器是一个容器，在此容器里，人们对生物有机体进行有效控制和培 养以生产某种产品，或进行特定的反应。生物反应器最早的形式是发酵罐 （fermentator）o生物反应器与化学反应器在使用中的主要不同点是生物（酶除 外）反应都以“自催化

2、”（autocatalysis）方式进行，即在目的产物生成的过程中 产物自身要生长繁殖。另外，由于生物反应速率较慢，生物反应器的体积反应速 率不高；与其它相当生产规模的加工过程相比，所需反应器体积大；对好氧反应, 因通风与混合等，动力消耗高；产物浓度低。生物反应器的作用就是为生物体代谢提供一个优化的物理及化学环境，使生 物体能更好地生长，得到更多所需的生物量或代谢产物。高效生物反应器的特点是设备简单，结构严密，良好的液体混合性能，较高 的三传（动量传递、质量传递、热量传递）效率，能耗低，易于放大，具有配套 而又可靠的检测及控制仪表灯。判断生物反应器好坏的标准应是该装置能否适合 工艺要求，以获得

3、最大的生产效率。3. 实验器材与试剂3.1实验器材5l发酵罐，控制台，ph电极，溶氧电极，蒸汽高压灭菌锅，高速离心机， 分光光度计（包括比色皿），恒温水浴槽，电热恒温鼓风干燥箱、loooml棕 色试剂瓶、100ml容量瓶，20ml试管、10ml离心管。3.2实验材料和试剂（1）材料菌种：面包酵母培养基：种子活化培养基（g/l）：酵母膏10,蛋白腺20,葡萄糖10, ph自然；液体培养基（g/l）：酵母膏10,蛋白腺20,葡萄糖20, ph自然.葡萄糖（分析纯）、氢氧化钠、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、蒸憾水（2）试剂img/ml葡萄糖标准溶液：准确称取分析纯葡萄糖100mg,置于100ml容

4、量瓶中，用蒸憾水溶解并定容至looml,摇匀，在冰箱中保存。3,5二硝基水杨酸(dns)试剂：准确称取185g酒石酸钾钠，用5o°c左右 的蒸憾水溶解。向此酒石酸钾钠热水溶液中先加入6.3gdns和262mlnaoh溶 液，再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌，使其溶解，冷却后加蒸憎水定容至 loooml,储存于棕色试剂瓶中，一周后使用。4. 实验方法f罐的实罐灭菌(1) 在罐内放入发酵培养液；拔下ph、do电极及电机的电器插头；(2) 注意拔下的接头不能缠绕接触、不可与罐体接触，放在干燥平台上；(3) 使用内六角扳手旋松搅拌电机固定螺栓，取下电机，横放在柔软、干燥桌 面上；(4)

5、将发酵罐放入高压蒸汽灭菌锅，设置好灭菌温度(121 °c)及时间(20min) 后开始进行灭菌；(5) 当设定的灭菌时间到时，仪器鸣叫报警，此时将灭菌锅电源关闭，让罐体 自然冷却；(6) 当灭菌锅内温度降到90°c以下吋，打开溢流阀排岀剩余蒸汽；(7) 当灭菌锅内常压状态时，打开灭菌锅，小心取出发酵罐，放置在基座上冷 却备用。4.2 ph电极及溶氧电极校正(1) ph电极的校止ph电极先后放入ph=6.86及4.0的标准溶液中进行标定。(2) ph电极的维护 ph电极不用时应将其浸泡在3mol/l的kc1溶液或kc1饱和溶液中，严 禁将电极浸泡与蒸憾水或自来水中。 若电极被

6、无机物污染，可用0.1 mol/l的hc1或naoh溶液清洗数分钟, 然后用蒸憾水洗净。若电极被有机物污染，可用酒精或丙酮清洗，然后用蒸憾水洗净。严禁用水或潮湿空气侵蚀电极上端和电缆线相连接处的高阻抗部件。(3) do (溶氧电极的校止)将溶氧电极分别放入4%的亚硫酸钠溶液中(校止零点)及空气中(100%标 定)。(4) 溶氧电极的维护 长期不用应将电极取下，放入电极盒。 严禁用液体浸泡、用蒸汽或潮湿空气侵蚀电缆线接头盒电极接头。 在每次换模或换电解液后，电极必须重新极化和校准。 极化需连续通电7h以上。4.3还原糖测定通过准确、快速测定发酵液总糖或述原糖的含量，可及时了解微生物对还原 糖的消

7、耗情况，并将此消耗情况与ph的变化情况进行关联分析，得到补料分批 式发酵过程的补糖策略，从碳源调控的角度实现发酵过程的优化。本次实验采用3, 5二硝基水杨酸(dns)比色法测定发酵液中还原糖含量。 述原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基 的单糖和含有游离酮基的二糖都具有还原性。还原糖在碱性条件下加热，被氧化成糖酸及其他产物，3,5二硝基水杨酸则 被还原为棕红色的3氨基5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色 物质颜色的深浅度呈一定比例关系。利用分光光度计，在540nm波长下测定反 应后混合溶液的吸光度，查标准曲线并计算，便可求岀样品中还原糖的含量。dns法

8、操作简便、快速、杂质干扰较少，故该法已逐渐得到推广和普及。 由于发酵液一般会有颜色，而且不同的发酵过程及不同发酵时期，发酵颜色的深 浅不一，采用dns法测发酵液中总糖的含量时，应视情况不同对发酵液进行适 当倍数的稀释，并离心分离出其中的固形物。在测吸光度时，建议用稀释后上清 液作为对照样品将其脱色后再进行测定。具体实验步骤如下：(1) 发酵液的预处理：取20ml发酵液，在高速离心机中以3000r/min的 转速离心lomin,取上清液。如果上清液颜色较深，可用活性炭脱色(参考用量: 0.5%5%)。(2) 标准曲线绘制：取6支20ml试管(有准确刻度)，分别编号为 0,1,2,3,4,5,按表

9、1分别加入葡萄糖标准溶液(浓度为lmg/ml)、蒸馆水和dns 试剂，配制成不同葡萄糖含量的反应液。将各试管振摇，使反应液混匀，然后将试管置于沸水浴中，5min后取出， 迅速冷却至室温，并加入蒸镭水9ml,加塞后摇匀。在54()nm波长处测05号 试管中溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标作图，再进行 线性拟合，得到标准曲线方程。表1不同葡萄糖含量的反应液的配制试管号1 mg/ml葡萄 糖标准溶液体 积(mg/ml)蒸馆水体积/(ml)dns试剂体积/(ml)反应液中葡萄 糖含量 (mg/ml)001.02.0010.20.82.00.220.40.62.00.430.60.4

10、2.00.640.80.22.00.851.002.01.0(3) 上清液还原糖含量测定：取20ml试管(有标准刻度)，按表1中7号试管加入上清液、蒸憎水和dns试剂，然后将试管置于沸水浴中，5min后取 出，迅速冷却至室温，加入蒸憾水9ml,加塞后摇匀。在540nm波长处测该试 管溶液的吸光度，将测出的吸光度代入标准曲线方程，即得到该上清液的还原糖 含量。空白样仍用0号试管中的混合液。4.4.1浊度法在科学研究和生产过程中，为及时了解培养微生物的生长情况，需定时测定 培养液中微生物的数量，以便适时地控制培养条件，获得最佳的培养物。比浊法 是常用的测定方法。比浊法是在浊度计或比色计上对培养液中

11、微生物数量进行测 定。某一波长的光线，通过混浊的液体后，其光强将减弱。入射光与透过光的强 度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。時=-kcd(1)式中ii为透过光的强度；i。为入射光的强度；k为吸光系数；c为样品液的 浊度;d为液层厚度；i/io称为透光度(tansmittance)o透光度的负对数称光密度(optical density, od),其表达式为：讥1 *0如果样品液层厚度一定，则od值与样品的浊度有关，根据此原理，可通过 测定样品中的od值来代表培养液中的浊度即微生物量。也可同时做平板计数 法，对比一定混浊度所含活菌数制成曲线。该法测定的是微生物的总量，适用于 菌体分散良好的非丝

12、状单细胞微生物的测定。在进行大量培养时，该法比平板计 数法能较快得出结果，省时省力。具体实验步骤如下：(1) 把比色计的波长调整到600nm,开机预热1015min。(2) 在比色杯中盛未接种的发酵液进行零点调整。(3) 将发酵液倒入相同类型的比色杯中，测定其od值。若菌液浓度大， 可适当进行稀释，使od值的读数仪00.4为最好。(4) 测定后把比色杯中的菌液倾入容器中，用水冲洗比色杯，冲洗水也收 集于容器中进行灭菌。最后用70%乙醇冲洗比色杯。4.4.2干燥法用20ml离心管(质量m)取20ml发酵液，于高速离心机3000rpm离心 lomin,弃上清液，将底部湿菌体连同离心管放入80 &#

13、176;c烘箱中烘干至恒重m?, 则菌体重量m()=m2-mi。5实验步骤(1)发酵罐及培养基灭菌 向发酵罐加入2.7l去离子水，按3.2材料中培养基浓度向发酵罐内加入一定质量的葡萄糖，酵母膏及蛋白陈。将装有培养 基的发酵罐一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌温度121°c,灭菌 时间20mino灭菌完毕后取出，放在发酵罐底座上冷却备用；(2) 连接好发酵罐保温装置，即底座处循环水管连接；(3) 校正ph及溶氧电极，将校正好的电极放入发酵罐内，并将电极与控制台 连接；(4) 种子活化和接种 将而包酵母(20g/l)接入种子活化培养基，28°c培养 24h后，取活化好的酵母菌种2环，接入已灭菌冷却的发酵罐中；(5) 培养：菌种接入发酵罐后，将发酵罐内的温度、ph分别调至28°c, 5.5； 调整桨叶转速及通风量至指定值，开始发酵；(6) 取样：培养过程中，每隔2h取两个样，按照实验方法对发酵液内还原糖 及菌体量进行测定，共取样5次；(7) 下罐：发酵结束后，拆下相应连接管