酶解对玉米醇溶蛋白水溶性的影响学士学位毕业论文

1、学士学位毕业论文酶解对玉米醇溶蛋白水溶性的影响学生姓名：陈俊学 号：20124064101指导教师：李丹所在学院：食品学院专 业：粮食工程黑龍一我鑒交孝中国大庆2016年5月摘要玉米醇溶蛋白是玉米黄粉其屮利用价值较高的副产物，其附加价值冇很高 的提升空间。木课题是以玉米醇溶蛋白为原料，通过胰蛋白iw水解玉米醇溶蛋白， 并测定水解后玉米醇溶蛋白的最佳水解条件，溶解条件，以及在两者最佳条件下， 醇溶蛋白对fe2+ cu2+的螯合能力的影响，以使其有更大的应用空间。通过单因素试 验研究，得岀胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋£1的最佳工艺条件为：反应时间2h,反应温 度27°c,酶添加量64

2、0u/g,玉米醇溶蛋白底物浓度为7%,乙醇浓度为75%,并对在 最佳工艺条件下水解的脱玉米醇溶蛋白的水解度和与fe2+zn2+螯合能力进行研究。 关键词：玉米醇溶蛋白，酶解，水解度，螯合能力abstractzein is the by-product of com gluten by high value, high added value promotion space. this topic is based on zein as raw materials, by trypsin hydrolysis of zein, and determination ofhydrolysis of

3、zein degree of hydrolysis and zn2+ chelating ability, provide a theoretical basisfor further development and utilization of zein. through single factor experiments, the optimumconditions of trypsin hydrolysis of zein protein:substrate concentration of 7% alcohol solublecom, reaction time 2h, ethanol

4、 concentration 75%, reaction temperature is 27°c, adding amount of enzyme 640u/g, and studied the hydrolysis under the optimum conditions of hydrolysis and zein the degree of protein key words: zein, trypsin, degree ofhydrolysis目录1. 前言11.1课题背景12材料与方法22. 1实验材料与设备22.1.1实验材料与试剂22. 1.2实验仪器设备32.2实验方

5、法32. 2. 4 一些重要的理化分析方法53结果与分析73朕蛋口酶水解玉米醇溶蛋口条件优化73.1.1反应时间对水解度的影响73.1.2反应温度对水解度的影响73.1.3酶添加量对水解度的影响83.1.4底物浓度对水解度的影响93.1.5乙醇浓度对水解度的影响103.3玉米醇溶蛋白及水解物与螯合能力的测定114. 讨论125. 结论12参考文献12致谢141.前吞1.1课题背景介绍玉米介绍玉米副产物溶蛋白性质应用发展前景我国玉米年产量已达1. 1左右亿吨，黑龙江省是我国玉米主产地之一。玉米 80%以上成份是淀粉类物质，它的出路决定了玉米深加工企业的发展，而玉米深加工金业的经济效益更多地来源于

6、玉米胚芽、玉米蛋白等副产品综合深加工。以低脂 玉米粉生产淀粉糖时，产生大量副产物玉米渣。玉米渣中含有30%左右的蛋白质, 其中70%为醇溶蛋口。经提纯后醇溶蛋口质含量高达90%以上。玉米醇溶蛋白有 较强的疏水性，为改善它的食品功能，就必须使其具冇水溶性。于是，利用酶解來研究对玉米醇溶性蛋白的影响成为重点。然而，限制玉 米醇溶蛋口蓬勃发展的最主要因素是其生产成本。为了扩大玉米综合利用的范围， 捉高玉米的附加值，为醇溶蛋白的开发和应用捉供理论依据。研究了从玉米蛋白粉 中提取醇溶蛋口的工艺，并建立了玉米醇溶蛋白提取量的快速检测方法，在单因素 试验的基础上采用中心组合设计法，确定了玉米醇溶蛋白的最佳提

7、取工艺条件：乙 醇浓度80%,提取温度60°c,液料比(ml/g)9. 25,浸提时间2h。产品提取率为50%, 产品为淡黄色粉末，其中蛋口质含量在90%以上同吋，玉米屮的蛋白质主要为醇溶蛋白，它具有一定的粘合力，易加工成薄膜 和纤维，其薄膜的耐水性、耐热性及耐酸性尤为出色，可用于食品、制药及其它领域。6112研究概况门20世纪70年代开始，世界上兴起玉米深加工业，美国是一马当先的国家。其 玉米原料利用率己达到98% 99%。然而，我国在这方面的工作还比较落后，除了 主产品淀粉以外，只有玉米油、粗蛋白粉等少数产品。由此可见，玉米的综合利用 及深加工是玉米产业化的根本出路。以玉米为原料

8、进行深加工的企业中，如生产淀 粉、淀粉糖、冇机酸、氨基酸等产品的工厂，都会产生大量的下脚料。在这些下脚 料屮，大约可以分离出占原料质量5%-6%的玉米蛋白粉，这类玉米蛋白粉的蛋白质 含量在60%左右，但由于缺少赖氨酸、色氨酸等人体必需氨基酸，其生物学价值低, 口前均作为低价值饲料蛋白出售，国际上每吨仅200多美元，国内每吨约2500元， 许多工厂甚至未作任何利用而自然排放。目前，我国每年随废液排放的玉米蛋口高 达8万多吨。玉米醇溶蛋口是玉米蛋口粉中的主要蛋口质，由于它不溶于水且缺乏赖氨酸、 色氨酸等必需氨基酸，还存在色泽和气味等问题，因而较少作为食品原料应用。但 玉米醇溶蛋白具有很好的成膜性、

9、凝胶化性及较强的抗氧化性等，随着高度脱色、 脱臭技术的发展，大大拓宽了其应用范围，使z成为一种用途广泛的工业原料。1.3本课题的目的、意义玉米淀粉生产工艺主耍是湿法工艺，用湿法生产玉米淀粉的过程中会产生许多 的玉米黄粉，玉米黄粉中含有60%以上的蛋白质，其中大多数为玉米醇溶蛋白，若 不加以利用，会造成很大的浪费，但玉米醇溶蛋白不溶于水，并存在色泽和气味问 题，其作为食品原料的应用较少，如果能通过改性使z改变某些功能性质，必会使 其在食品等其他方而冇所深入。木课题研究了其主要蛋白，玉米醇溶蛋白的最佳水解条件，溶解条件，以及在 两者最佳条件下，醇溶蛋口对fe2+ cu2+的螯合能力，以使其有更大的

10、应用空间。2材料与方法2. 1实验材料与设备2.1.1实验材料与试剂材料玉米黄粉邻苯二甲醛（化学纯）l亮氨酸氢氧化钠来源龙岗淀粉厂中国医药集团上海化学试剂公司 天津市光复精细化工研究所 天津市大茂化学试剂厂硫酸锌天津市大茂化学试剂厂硫酸铜天津市大茂化学试剂厂硫酸钾天津市大茂化学试剂厂硼酸沈阳市化东试剂厂浪甲酚绿犬津市博迪化工有限公司甲基红天津市i専迪化工有限公司无水乙醇沈阳市化东试剂厂十二烷基磺酸钠(sds)天津市红岩化学试剂厂磷酸天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠天津市大茂化学试剂厂磷酸氢二钠犬津市大茂化学试剂厂甲酚橙指示剂天津市大茂化学试剂厂碳酸钠天津市大茂化学试剂厂氯化亚铁天津市东丽区天大化

11、学试剂厂edta天津市大茂化学试剂厂ferrozine天津市大茂化学试剂厂卩铳基乙醇天津市光复精细化工研究所酒石酸钾钠沈阳市化东试剂厂所有药晶除特殊说明外均为分析纯2.1.2实验仪器设备仪器型号厂家奥豪斯国际贸易(上海)有限公电了大平ar224cn司可见分光光度计722s上海精密科学仪器有限公司精密定时电动搅拌jj-1江苏省金坛市荣华仪器制造有限器公司电热恒温水浴锅dk-s12上海森信实验仪器有限公司ph计phs-3c上海虹益仪器仪表有限公司全自动凯式定氮仪foss2300瑞典foss公司消化炉q/idyqhyp- ii上海纤检仪器有限公司全温振荡培养箱hzq-f160江苏省金坛市荣华仪器制造

12、有限 公司台式离心机ld4-1.8北京京立离心机有限公司冷冻干燥机lgj-1上海医用分析仪器厂2. 2实验方法2. 2.1提取玉米醇溶蛋白的工艺流程取"（1）最适条件：乙醇浓度80%；提取温度57.90 液料比（ml/g）9. 25；浸提 时间2h0（2）工艺流程:玉米黄粉一粉碎过筛（70目筛）一浸泡提取（体积分数80% 乙醇，用氢氧化钠lmol/l调至ph为8左右）离心分离（3000r/min, 15min） 提取液f冷水（10°c）-稀释乙醇浓度至40%-调节ph （用盐酸lmol/l调至ph为6. 2左右）-静置沉淀（30min）-水洗至中性一冷冻干燥一剧碎一成品2.

13、 2.胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白本实验通过研究乙醇浓度、底物浓度、反应温度、ph来得出玉米醇溶蛋白的 最佳水解条件，溶解条件。2. 2. 2.1乙醇浓度对胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影响称取一定量的玉米醇溶蛋白，并分别溶于乙醇浓度70%、75%、80%、85%、90%五 个浓度梯度的乙醇溶液,将反应体系的盐酸浓度调制ph为9,反应温度固定为45°c, 反应时间为lh,底物浓度5%,酶浓度5u/mlo反应过程屮，用水浴摇床进行震荡， 使玉米醇溶蛋白与氢氧化钠充分反应。按照2. 2.4. 2测定水解程度。按照2. 2. 5. 3 测定溶解度.2. 2. 2. 2酶添加量对胰蛋白酶水解玉米醇溶

14、蛋白的影响将酶浓度分别配成为lu/ml, 3u/ml, 5u/ml, 7u/ml, 5u/ml, 9u/ml五个梯度的悬 浮液。用移液管称取一定量的盐酸。将反应体系的盐酸浓度调制ph为9,反应温 度固定为45°c,反应时间为lh,乙醇浓度为80%。反应过程中，用水浴摇床震荡, 使玉米醇溶蛋白与氢氧化钠充分反应。按照2. 2.4.2测定水解程度。按照2. 2. 5. 3 测定溶解度.2. 2. 2. 3反应温度对胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影响将反应体系的盐酸浓度调制ph为9,反应时间为lh,乙醇浓度为80%,底物浓度 5%,酶浓度5u/ml并分别在35°c、40°c

15、. 45°c、50°c、55°c五个温度梯度卜-反应中， 用水浴摇床震荡，使玉米醇溶蛋口与氢氧化钠充分反应。按照2. 2. 4. 2测定水解程 度。按照2. 2. 5. 3测定溶解度.2. 2. 2.4ph对胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影响将反应体系的浓度分别调为ph8, 8.5,9, 9.5, 10五个浓度梯度进行反应lh, i佃乙醇浓度为80%,温度为45°c,底物浓度5%,酶浓度5u/mlo反应过程屮， 用水浴摇床震荡，使玉米醇溶蛋白与氢氧化钠充分反应按照2. 2. 4. 2测定水解程 度。按照2. 2. 5. 3测定溶解度。2. 2. 3玉米醇溶蛋

16、白水解物与金属离子螯合能力的研究2. 2. 3.1对二价铁离子螯合能力的研究问采用ferrozine显色法测定二价铁螯合能力。准确吸取250 口 l lmg ml-1的 样品溶液（样品最终浓度为100 ng-ml-1）直接与x ul 1 mmol l-1的fcc12 溶液混合（最终浓度为1060 umol -l-1,此溶液现用现配fec12）,加入一定量 的超纯水，使反应体系终体积为1.5mlo混匀后，放置2 min,再加入lml 500 u mol l-1 的 ferrozine 显色剂水溶液（ferrozine 终浓度为 200 u mol l-1）, 充分振荡、混匀。混合体系在室温下静置

17、10 min,使fe2+与ferrozine充分结合, 形成fe2+-ferrozine复合物，然后用紫外分光光度法在562 nm条件下测吸光值。 对照样中加入一定量的edta钠盐溶液（终浓度为10 nmol l-1）2. 2. 3. 2对二价锌离子螯合能力的研究网取5 ml反应液于烧杯中浓缩至近t,加入15 ml无水乙醇，混匀后5 000 r/min 离心20 min,取沉淀并用蒸惚水定容至50 ml。用edta络合滴定法测定螯合态锌 的含量。移取容量瓶屮溶液20讥至锥形瓶屮，加两滴二卬酚橙指示剂（0.5%水溶 液）,滴加质量分数为20%的六亚甲基四胺-盐酸缓冲液（ph 5.0）至溶液呈稳定

18、 的紫红色后再加入4 ml缓冲液，用已标定的0. 001 mol/l edta溶液滴定至溶液由 紫红色变成黄色，记录edta的消耗量2. 2.4 些重要的理化分析方法2. 2. 4.1蛋白质含量一凯氏定氮法取m盐酸标准滴定溶液配制方法-gb/t 5009. 1-2003；甲基红-渙甲酚绿混合指示 剂配制方法gb/t 5009. l-2003o称取0.20 g或5ml待测样品加入到消化管中,分别称取3. 00 g硫酸钾、0. 10 g硫酸铜加入消化管，加入10ml浓硫酸，将消化管置入消化炉屮消化，用小火缓 慢加热，使溶液保持在沸点以下，待泡沫消失后，加强火力并保持管内液体沸腾， 逐渐升温至420

19、 °c，待消化管屮的液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热30min后, 自然冷却。将消化管取下，使用全自动凯氏定氮仪直接进行蒸憎和滴定。硼酸吸收 液、氢氧化钠溶液、水加入量分别为30ml、40ml、50ml,在仪器显示屏上读取氮 含量结果（单位mg+gi或mgn-ml1）,然后计算蛋白质含量。平行试验3次，平均 值为测定结果。2. 2. 5. 2蛋白质水解度opa分光光度法木研究采用opa分光光度法测定游离氨基氮，采用凯氏定氮法测定总氮的方法 测定水解蛋门的水解度。1、实验原理碱性条件下，opa在b-毓基乙醇（btice）存在的条件下能够与游离氨基迅 速反应生成1-硫代-2-烷基异n引味

20、。此加成产物在340mn处有较强的吸收，并对所 冇的a -阳2吸光系数相同，另外a讯出和£ -“也的吸光系数也相同。运用十二烷基 磺酸钠(sds)将蛋白变性后，其吸光系数将不受影响，从而可以利用分光光光度 法测定蛋白质在水解前后的游离氨基的含量，进而能够计算出水解过程屮释放出的 游离氨基的量。2、试剂的配制(1) opa溶液:准确称取2. 00g -1二烷基磺酸钠(sds),加入30ml 0. 4mol -l 1 的硼酸缓冲液(ph 9.5),水浴加热使其完全溶解，冷却至室温后再加入lml浓 度为80 mg ml?的opa乙醇溶液和200 u l 3 -疏基乙醇，最后用ph 9. 5

21、的硼酸 缓冲液定容至loomlo此溶液现用现配。(2) 600ug的亮氨酸标准溶液：精确称取亮氨酸0. 3000 g,加入5ml浓 度为imol 的盐酸溶液使其完全溶解，用蒸诸水定容至100ml,其浓度为3000 m g ml 1,再取此液10ml,用蒸谓水定容至50ml,即配成600 u g ml 1的亮氨酸标 准溶液。此溶液配成后应及时使用或放入4°c冰箱内保存。3、标准曲线的绘制取不同体积的标准亮氨酸溶液，配成不同浓度的溶液(0、12、18、24、30、36 u g ，再各取稀释液3ml,与同体积的opa试剂混合并开始计时，准确计时5 min,立即在340nm处测定溶液吸光值。

22、每个浓度做3个平彳亍，以吸光值的平 均值为横坐标，亮氨酸浓度为纵坐标，绘制标准曲线。4、样品屮游离氨基含量和蛋白质水解度(dh)的测定将待测样品按一定倍数稀释后，取稀释液3ml,按照标准曲线制作步骤，测定 其吸光值。然后利用标准莒线所得方程，计算出样品中游离氨基的浓度(卩 mol-mlf1) o水解度计算公式如下，其中计算大豆分离蛋白水解度时a二5.71；计算酪蛋白水解度时a二6. 38：0.76(mmol / g) ht (mmol / g) x 100dh 仔)-1水用军物游离氨基含量/ 忆)a x水解物氮含量(nig / ml)2. 2. 5. 3福林法测定蛋白质含量氮溶解指数(1)试剂

23、的配置： 试剂甲： 4 %碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠(na2c03) 20 g,定容至500 ml； 0. 2 mol l '氢氧化钠溶液；(3) 1 %cuso4 5h20：准确称取0. 5 g cuso4 5h20,定容至50 ml；2 %酒石酸钾钠：准确称取10 g酒石酸钾钠，定容至50 mlo使用前，分别将与、与等体积混合，再将两混合液按50 : 1比例混合, 即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。试剂乙：福林试剂的配置。于2000 ml磨口回流装置内，加入铸酸钠(na2wo4 - 2h20) 100 g,铝酸钠 (na.moo., 2h20) 25 g,蒸憎水 700 ml

24、, 85 %磷酸 50 ml,浓盐酸 100 ml,文火冋 流 10 ho取去冷凝器，加入硫酸锂(li2so4) 50 g,蒸饰水50 ml,混匀，加入几滴液体 漠，再煮沸15 min,以驱逐残澆及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴澳液，再煮沸除去之。冷却后，定容至loooml,用漏斗过滤， 置于棕色瓶屮保存。此溶液使用时加1倍蒸傭水稀释，即成已稀释的福林试剂。(2) 标准蛋白质溶液的配置：准确称取一定量的牛血清门蛋门，配置成0.25 mg ml_i标准蛋门质溶液。(3) 标准曲线的绘制及蛋白含量的测定：牛血清口蛋口标准曲线的测定过程及样品蛋口质含量测定的操作步骤如表

25、2-2 所示。按照表2-2所示的测定过程，以牛血清白蛋白的质量为横坐标，吸光值入6。为 纵坐标绘制标准曲线，得到牛血清白蛋口的质量与吸光值血6。关系方程。根据测定 得到的待测样品的吸光值及上述方程，计算蛋白质含量。表2-2样品蛋白质含量的测定过程ns/(%) =上清液中可溶性氮含量x空白12样品345样品蛋门质标准溶液0.20.40.60.81.0(ml)蒸憾水(ml)1.00.80.60.40.20待测样品(ml)1.0试剂甲(ml)5.05.05.05.05.05.05.0使上述混合溶液充分混匀，20-25°c水浴10 min试剂乙0.50. 50. 50. 50. 50. 50

26、. 5加入试剂乙后立即混匀，20-25 °c 水浴 30miri 后,660nm处测定吸光值2、氮溶解指数(ns1)的测定(gb/t 5511-2003)样品经处理后，离心，分别测定上清液和样品屮的总氮含量，并按下式计算:3结果与分析3.1胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白条件优化3.1.1反应时间对水解度的影响3.1.2反应温度对水解度的影响将玉米醇溶蛋白用80%乙醇水溶液调配成5%的悬液，并用0.2 moll"的naoh 溶液将蛋白溶液ph调至8.0,加酶量为840u/g的胰蛋口酶，分别在22°c、27°c、32°c 37°c、42

27、6;c五个温度梯度下反应2h°反应过程中，加入一定量的naoh溶液，保证 反应过程中反应体系的ph在&0。反应完成后，将反应容器在沸水浴中加热 1015min,使酶失活,终止反应。结果如图32。3010222732温度°c3742图3-2反应温度对玉米醇溶蛋白水解度的影响figure 3-2 reaction temperature influence soluble protein hydrolysis degree of corn alcohol从图32中可以看出，在其他的条件相同的情况，反应温度在27°c-42°c之间, 随着温度的升高，玉

28、米醇溶蛋白的水解度呈现先上升后下降的趋势，在反应温度为 27°c吋，水解度为25.63%,达到最大值。当反应温度达到32°c时，水解度已经开 始下降，在此之后的几个温度梯度里水解度呈现出人致相同的下降幅度。呈现这种 结果的原因，可能是在达到最适温度27°c之前，随着温度的升高，水解反应的速 率增加，在达到最适温度之后再提高温度，温度过高而是玉米醇溶蛋白构想被破坏, 从而降低了膜蛋白酶与底物的冇效结合，影响酶与底物复合物的形成，使水解度下 降。另一个原因口j能是随温度升高而使酶逐步变性，冇活性的酶减少，从而使膜蛋 白酶水解玉米醇溶蛋白反应速率下降，酶构象改变，酶活性

29、渐渐丧失，反应速度很 快下降。因此，27°c为最适反应温度。3.1.3酶添加量对水解度的影响将玉米醇溶蛋口用80%乙醇水溶液调配成5%的悬液，并用0.2 mol-u1的naoh 溶液将蛋口溶液ph调至8.0,分别加入酶量为440u/g、540u/g、640u/g、740u/g、 840u/g五个用量梯度的朕蛋口酶，在37°c下进行水解反应2h。反应过程中，适当 加入一定量的naoh溶液，保证反应过程中反应体系的ph在&0。反应完成后， 将反应容器在沸水浴中加热1015min,使酶失活，终止反应。结果如图33。3015440540640740840酶添加量u/g图3-

30、3酶添加量对玉米醇溶蛋白水解度的影响figure 3-3 adding amount of enzyme solution influence protein hydrolysis degree of comalcohol 从图33中可以看出，在其他条将相同的情况，酶添加量在440u/g-840u/g 之间，玉米醇溶蛋口的水解度呈现先上升后下降的趋势，酶添加量在640u/g时， 水解度是26.76%,达到最大值。当酶添加量增加到740u/g后，水解度反而开始下 降。可能是在底物浓度一定的条件下，加酶量较低时，酶己经与底物全部结合，所 以加酶量越多水解速度越快，水解度上升明显，但是随着酶添加量的

31、继续增加，反 应体系中酶的浓度过高，酶与酶之间产生了竞争性抑制，导致了酶量增加，水解度 却不再增加甚至降低。因此，酶添加量的最适条件是640u/g。3.1.4底物浓度对水解度的影响将玉米醇溶蛋白用80%乙醇水溶液分别调配成1%、3%、5%、7%、9%五个浓 度梯度的悬液，并用0.2 mopl-1的naoh溶液将蛋白溶液ph调至8.0,加酶量为 840u/g的胰蛋白酶，在37°c下进行水解反应2h。反应过程中，适当加入一定量的 naoh溶液，保证反应过程中反应体系的ph在8.0。反应完成后，将反应容器在沸 水浴中加热1015min,使酶失活，终止反应。结果如图34。25 ra图3-4底

32、物浓度对玉米醇溶蛋白水解度的影响figure 3-4 substrate concentration effect of solution protein hydrolysis degree of com alcohol从图34中可以看出，在其他条将相同的情况，底物浓度在1%9%之间，玉米 醇溶蛋口的水解度随着底物浓度的增加呈现向上升后下降的趋势，底物浓度在7% 时，水解度是20.05%,达到最大值。当地物浓度超过7%,水解度反而下降。对该 结果分析原因，应该是由于酶添加量相同时，随着底物浓度的增加，水解较快，当 底物浓度达到一定浓度以后，玉米醇溶蛋口的含量较高，粘性较大，蛋口不能充分 浸润，

33、胰蛋口酶与玉米醇溶蛋口不能完全接触，影响了胰蛋口酶对玉米醇溶蛋口的 作用。在较低底物浓度时，随着底物浓度增加，蛋口质水解度和降解率都逐渐增大, 这是因为随着底物浓度增加，胰蛋口酶与底物蛋口分子态间的接触儿率增加，使可 水解的肽键数增加，但底物浓度增加到一定程度后再继续增加，水解度下降。因此, 水解反应的底物浓度以7%为最适底物浓度。3.1.5乙醇浓度对水解度的影响将玉米醇溶蛋白分别用70%、75%、80%、85%、90%五个浓度的乙醇水溶液 分别调配成5%的悬液，并用0.2 mobl-1的naoh溶液将蛋h溶液ph调至8.0, 加酶量为840u/g的胰蛋白酶，在37°c下进行水解反应

34、2 h。反应过程中，适当加 入一定量的naoh溶液，保证反应过程中反应体系的ph在&0。反应完成后，将 反应容器在沸水浴中加热1015min,使酶失活，终止反应。结果如图35。107075808590乙醇浓度图3-5乙醇浓度对玉米醇溶蛋白水解度的影响figure 3-5 the concentration of ethanol soluble protein hydrolysis degree of com alcohol从图35中可以看出，其他条件相同的情况，当乙醇浓度在70%-90%之间吋， 玉米醇溶蛋白的水解度呈现出先上升后下降然后趋于平缓的趋势。反应之处，水解 度随着乙醇浓度的

35、增加而升高，当乙醇浓度增加到75%是，水解度是23.52%,达 到最人值。当乙醇浓度超过75%时，水解度随着乙醇浓度的壇加而降低，当乙醇浓 度超过80%以后，水解度趋于平缓趋势。根据资料，玉米醇溶蛋白溶于70%-92% 的乙醇中，不溶于水和无水乙醇，故过低的乙醇浓技或较咼的乙醇浓技不利于玉米 醇溶蛋口的溶解，即不利于胰蛋口酶与玉米醇溶蛋口结合，所以水解度较低。但是 同时胰蛋口酶在乙醇溶液中也会发牛变性，太高浓度的乙醇溶液会影响胰蛋白酶的 作用性质，从而也会导致水解度的下降。因此，水解反应的乙醇浓度以75%为最适 反应浓度。综上，胰蛋口酶水解玉米醇溶蛋口的最适反应条件为：反应时间2h,反应温 度

36、27°c,酶添加量640u/g,玉米醇溶蛋口底物浓度为7%,乙醇浓度为75%o根拯 上述最适的反应条件，反应分别进行不同时间并制备具有不同水解度的玉米醇溶蛋 口产物，制备结果如下：反应时间分别控制在lh、2h,制备出水解度分别为21.63%、 26.76%的玉米醇溶蛋口水解产物。3.3玉米醇溶蛋白及水解物与zr）2+螯合能力的测定将未反应的蛋白质和上述实验制备的两种玉米醇溶蛋白的水解产物进行与 zr?+螯合能力的测定。样品锌离子螯合能力的测定参照wang等的方法，计算方法略冇改动。锌肽螯合反应：取1.0 ml 0.05 mol/lznso4 （乙醇溶解）于25 ml离心管中， 缓慢滴

37、入10 ml 0.14% （w/v）的样品溶液（用体积分数为50%的乙醇溶解），室 温下搅拌反应lh,至有白色沉淀生成。肽螯合锌含量的测定：取5ml反应液于烧杯中浓缩至近干，加入15 ml无水 乙醇，混匀后5 000 r/min离心20 min,取沉淀并用蒸水定容至50 ml。用edta 络合滴定法测定螯合态锌的含量。移取容量瓶中溶液20 ml至锥形瓶中，加两滴二 甲酚橙指示剂（0.5%水溶液），滴加质量分数为20%的六亚甲基四胺盐酸缓冲液 （ph 5.0）至溶液呈稳定的紫红色后再加入4 ml缓冲液，用已标定的0.001 mol/l edta溶液滴定至溶液出紫红色变成黄色，记录edta的消耗量

38、。根据edta的消 耗量计算出与z+螯合能力。结果如图37。图中：玉米醇溶蛋白1水解度21.63%；玉米醇溶蛋白2水解度26. 76% 图3-7不同水解度的玉米醇溶蛋白与z+螯合能力豈iu7耀仑翔uz7 4-.figure 3-7 zrt chelating ability of different degree of hydrolysis of com alcohol从图37中可以看岀，同一种蛋口质在不同水解度的情况下，与z/+螯合能力 有一定差异。随着玉米醇溶蛋口水解度的增加，各口与螯合能力呈升高趋势。 未参与反应的玉米醇溶蛋口与螯合能力是0.11,最适条件下水解lh后的玉米 醇溶蛋口的水

39、解产物与螯合能力是0.18,最适条件下水解2h后的玉米醇溶蛋 口的水解产物与z/十螯合能力是0.26。分析其原因，可能是水解程度越大，多肽暴 露出来的能够与z£+结合的基|才|越多，所以与z/'螯合能力越强。玉米醇溶蛋口分 子中的大量氨基及部分酰胺基的存在，能够选择性地配位或吸附一些金属离子，尤 其是对过渡金属离子具有较好的螯合能力，例如z/j水解后的醇溶蛋口的氨基部 分也随之增多，与z/十的螯合能力显著增强。4讨论玉米醇溶蛋白分子屮的大量氨基及部分酰氨基的存在，能够选择性地配位或吸 附一些金屈离子，尤其是对过渡金屈离子具冇较好的螯合能力，食品领域有广泛的 应用前景0。但是，

40、由于大分子链的影响，使配位基与金屈离子配位受到一定的空 间阻碍。为捉高吸附量，选择对玉米醇溶蛋白进行水解反应，高选择性的重金屈离 子配位吸附剂，以z1?+为模板，采用先使玉米醇溶蛋白与金屈离子在均相屮配位反 应，制得玉米醇溶蛋白与z1?+螯合物。本实验中，首先要研究胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最适条件，通过单因素反 应，得出结论，最终确定的最适反应条件为：反应时间2h,反应温度27°c,酶添 加量640u/g,玉米醇溶蛋白底物浓度为7%,乙醇浓度为75%o在上述的反应条件 下，制备岀水解度为26.76%的水解后的玉米醇溶蛋白产物。5结论木试验主要是以玉米醇溶蛋白为底物，采用胰蛋白iw对

41、玉米醇溶蛋白进行水解 试验，使整个反应体系保持恒定不变为10毫升。通过对水解反应过程屮反应吋间、 反应温度、酶添加量、底物浓度以及乙醇浓度等条件进行单因素反应，从而确定出 最适反应条件。胰蛋白晦水解玉米醇溶蛋白的最适反应条件为：反应吋间2h,反 应温度27°c,酶添加量640u/g,玉米醇溶蛋白底物浓度为7%,乙醇浓度为75%。 在上述的反应条件下，制备出水解度为26.76%的玉米醇溶蛋白水解产物。将玉米 醇溶蛋白及玉米醇溶蛋白水解物与+螯合，发现玉米醇溶蛋白被胰蛋白酶水解以 后提高了与+螯合能力，可以扩大玉米醇溶蛋白在食品屮的应用范围。参考文献1, 10, 12, 13, 14段纯