酶工程实验85330

1、实验一 过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。实验原理h2o2被过氧化氢酶分解岀出0和02，未分解的h2o2用kmno4在酸性环境屮滴定，根据反应前后h2o2的浓度差可求出反应速度。eh2o2>2 h2o+ o22kmno4+5h2o2>2mnso4+k2so4+5o2+8h2o本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/v1/s作图求km三、实验器材1. 锥形瓶 100150ml (x6)o2. 吸管 1.0ml (x2)、0.5ml (x2)、2.0ml (x2)、5ml (x2)、10.0ml (xl)o3. 温度计(0100°c)o

2、4. 微量滴定管5ml (xl)o5. 容量瓶 1000ml (xl)o四、实验试剂1、0. 02mol/l磷酸缓冲液(ph70)取磷酸二氢钾0. 68g,加0. lmol/l氢氧化钠溶液29. 1ml,用水稀释至100ml, 即得。2、酶液：称取马铃薯5g,加上述缓冲液10ml,匀浆，过滤。3、0.02movl kmno4 :称取 kmno4 (ar) 3.2g,加蒸徭水 1000ml,煮沸 15min, 2d后过滤，棕色瓶保存。4、0.004mol/l kmno4 :准确称取恒重草酸钠02g,加250ml冷沸水及10ml 浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/l的kmm)4滴定至微红色，水浴，

3、加 热至65°c,继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算岀kmno4的准确 浓度稀释成0.004mol/l即可。5、0.05 mol/l h2o2：取30% h2o2 23ml加入1000ml容量瓶中,加蒸憎水至刻度（约0.2mol/l）,用标准kmno4 （0.004mol/l）标定其准确浓度，稀释成 0.05mol/l（标定前稀释 4 倍，取 2.0ml,加 25% h2so42.0ml,用 0.004mol/lkmno4滴定至微红色）。6、25% h2so4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定号试剂0123450.05mol/l hpc/ml01

4、.001.251.672.55.00蒸憾水/ml9.58.508.257.837.04.50酶液/ml0.50.50.50.50.50.5先加好0.05mol/l h2o2及蒸懈水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应 时间。各瓶时间达5min时立即加2. 0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀。用 0.004mol/lkmno4滴定各瓶屮剩余的h2o2至微红色，记录消耗的kmncu体积。六、计算分别求出各瓶的底物浓度s和反应速度voshdvi/10cl vi c2v：u =5式中s：底物物质的量浓度（mol/l）；5： h2o2物质的量浓度（mol/l）；vi： h2o2体积（ml）；10

5、：反应的总体积（ml）；u：反.应速度 （m mol/min）；c2： kmncu物质的量浓度（mol/l）；v2： kmno4 体积（ml）；以1/u对1/s作图求出kim实验二酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定一、目的：了解酶的纯化方法。二、原理：酵母中含有丰富的蔗糖酶(ec.3.2.1.26),本实验以酵母为原料，通过破碎细 胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。(请参考相关教材)三、试剂与仪器1、试剂与材料：(1) 干酵母(2) 右英砂(3) 1 mol/l醋酸溶液(4) 2 mol/l氧氧化钠溶液(5) 醋酸缓冲液(ph 4.6)(6) 5%蔗糖溶液(7) dns (3,5二硝基水杨

6、酸)试剂2、仪器:电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、 移液管。四、操作方法1、破碎细胞取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min, 放入冰箱冷冻室(-20°c )冰冻约20 min (研磨液面上刚出现冰结为宜)。取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min,小心 取岀上清液(组分一)并量岀体积分别取0. 5 ml ±清液到试管a、b屮，余 者倒入三角瓶。2、纯化把三角瓶中的上清液用1 mol/l醋酸溶液调pll 5.0 （试纸）。然后迅速放入 到55 °c的

7、水浴中，保温30 mino之后在冰浴中迅速冷却。在5000 r/min条件 下离心12 mino取出上清液（组分二）并量出体积也，分别取0. 5 ml ±清液到 试管c、d屮。3、酶反应取四支试管，分别按顺序加入反应物:试管编号酶液氢氧化钠溶液醋酸缓冲液蔗糖溶液a （对照管）0. 5 ml1 ml1 ml1 mlb0. 5 ml2 ml1 mlc （对照管）0. 5 ml1 ml1 ml1 mld0. 5 ml2 ml1 ml试管屮反应物在55 °c水浴屮反应5 min （秒表计时）后，b、d管立即各加 入1 ml氢氧化钠溶液（2 mol/l）终止反应，a、c管屮各加入1

8、ml蒸饰水。4、酶催化产物检测取5支试管，分别加入反应物:试管编号反应液dns试剂10. 5 ml a0. 5 ml20. 5 ml b0. 5 ml30. 5 ml c0. 5 ml40. 5 ml d0. 5 ml5 （空白）0. 5 ml蒸侧水0. 5 ml试管中反应物在沸水浴中反应5 min,然后冷却。加入4 ml蒸馆水。将各试管摇匀，用空口管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值a540。五、结果计算1、酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55°c条件下，每1 min催化底物转化为1 mg述原糖的酶量。2、酶活计算:粗酶的计算酶活（组分一人4.5x0.5纯化后

9、酶的计算酶活（组分二）:(dabscabs)xx54.5x0.53、总酶活的计算：总酶活1 （组分，粗酶）：计算酶活x稀释倍数（裁总酶活2 （组分二，纯化后酶）：计算酶活x稀释倍数鲁4、酶活回收率的计算:酶活冋收率=总酶活2总酶活1x100%附：还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含冇自山醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖, 双糖和多糖不一定是还原糖，-m'l'乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是菲还原糖。利用糖的溶解度不同, 可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出來，对没冇还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解 成有还原

10、性的单糖进行测定，再分别求岀样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以術萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3氨基5 硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品屮还原糖和总糖的含量。实验三 蔗糖酶包埋及固定化酶活测定六、目的：了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。七、原理：海藻酸钠在遇到ca?+时成胶，从而把酶包埋在其中。（请参考相关教材）八、试剂与仪器1、试剂与材料：（8）干酵母（9）海藻酸钠(10)无水氯化钙(11)5%蔗糖溶液(1

11、2)dns （3,5二硝基水杨酸）试剂2、仪器:电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移 液管、注射器（带7号针头）、纱布。九、操作方法4、配a液取0. 75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馆水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分 溶胀。自然冷却。5、配b液取1 g干酵母溶在25 ml蒸憾水中（室温），搅匀。6、配c液a液冷却后，将b液倒入其中，搅匀。4、配cacb液取2.2 g无水cac12溶于200 ml蒸係水中。5、制备胶珠用注射器（7号针头）将c液滴入cac12溶液，滴时不断搅拌溶液。静置20 min, 固化胶珠。纱布过滤得到胶珠，用蒸惚水清洗胶珠，称取湿胶珠质量

12、（w1）, 并记录。6、催化取1 g湿胶珠置于烧杯屮，加入20 ml 5%蔗糖溶液，37°c反应10 min,取出 反应液，与胶珠分离，反应终止。7、酶催化产物检测将反应液定容至20 ml,取0.5 ml稀释至5 ml,得d液。取2支试管，分别加入反应物：试管编号反应液dns试剂10. 5 ml d0. 5 ml2 （空白）0. 5 ml蒸侧水0. 5 ml试管中反应物在沸水浴中反应5 min,然后冷却。加入4 ml蒸馅水。将各试 管摇匀，用空口管溶液调零点，测定它们的吸光度值a540。十、结果计算5、酶活力单位的定义：木实验屮，蔗糖酶的活力单位指在37°c条件下，每1 m

13、in催化得到1 mg还 原糖所需酶量。人八><5§20-lxx100.5 0.56、酶活计算：1 g固化酶酶活：十一、思考题1、海藻酸钙包埋法中钙起什么作用？与豆腐制作中ca2+的作用冇何关系？2、除了凝胶包埋法，还有哪些包埋方法？其原理是什么？实验四尼龙固定化木瓜蛋白酶一、目的：了解共价交联法固定酶的原理和步骤尼龙是聚酰胺物质，经iic1水解后暴露出游离nii2, nh2与戊二醛反应，尼 龙即成活化载体，可与酶表面nh2反应，把酶连在尼龙上。三、实验材料、仪器和试剂1、材料尼龙布(86或66), 140目,剪成3cm x 3cm2、仪器(1)恒温水浴锅(2)紫外分光光度

14、计(3)冰箱3、试剂(i) 18. 6%cacl2 溶液(2)甲醇溶液 (3)3. 65mol/lhcl 溶液(4) 0. 2mol/l硼酸缓冲液(ph值& 5)(5) 5%戊二醛溶液：用0. 2mol/l硼酸缓冲液配制,ph值& 5(6) 0. lmol/l磷酸缓冲液(ph值7.8)(7) lmg/ml木瓜蛋白酶溶液 0. 5mol/l nacl 溶液(9) 0. lmol/l 磷酸缓冲液(ph 值 7. 2)(10)激活剂:用0. lmol/l磷酸缓冲液(ph值7. 2)配制,含20mmol/l半胱氨酸、 lmmol/ledta的混合液。(ii) 0. 5%酪蛋白溶液:用0

15、. lmol/l磷酸缓冲液(ph值7. 2)配制。仃2)10%三氯乙酸(tca)溶液。四、操作步坍1、固定化酶的制备每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18. 6%cacl2溶液10s,再浸入18. 6%水的甲醇溶液屮，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸 干。(2) 将尼龙布用3. 65niol/l hci溶液在室温下水解45min,用水洗至ph值屮性(ph 试纸检测)。(3) 将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20mino(4) 取出尼龙布，用0. lmol/l磷酸缓冲液(ph值7. 8)洗涤3次，洗去多余的戊 二醛，吸干之后，加入5ml lmg/ml的木瓜蛋白iw

16、液，在室温下固定30mino(5) 从酶液中取出尼龙布,用0. 5mol/l nacl溶液(用0. lmol/l磷酸缓冲液(ph 值7. 2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化晦。2、a.b.c.酶活力测定0. 2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+lml酪蛋白液0. 2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml 10%三氯乙酸+lml酪蛋口液 固定化酶一张(剪碎)+2. 0ml激活剂+lml酪蛋白液取三支试管按上述加入反应液，37°c反应15min, a、c+2ml 10%三氯乙酸。三支试管过滤上清液到另三支试管中，以b管作空口，测试管a、c吸光值(280nm, 紫外)五、结果计

17、算2.酶活回收二1.酶活定义：每15min壇加0. 001个消光值所需酶量为1个酶活单位。六、注意事项(1) 尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，乂不能使其破碎。(2) 固定化酶溶液浓度最好为0. 5lmg/ml,对每块尼龙布用量不宜超过0. 8mlo(3) 酶活性测定的反应时间一定要准确。实验四、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基木原理和筛选方法。二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养棊中的淀粉， 由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉(本实验为rbv淀粉，呈鲜艳的紫红色), 当其被淀粉酶作川后便形成可溶，r较易扩散的小

18、分水解物，从而在该菌落周围形成颜 色佼浅的透明圈。而透明圈直径与菌落直径z比则对反应菌落分泌淀粉他能力的高低。 本方法有快速、简单易行等优点。图1产淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、试剂和仪器1、菌的来源取不同地点的表层土壤。2、试剂：rbv-starch (sigma) , nano3, k2hpo4, mgso4, kc1, 2 mol/l naoh 无菌水和琼脂 粉等。3、器皿250ml三角瓶两个、9.0cm培养皿若干、涂布棒、200gl移液枪、200gl枪头 若干、牙签若t、指形管若干、loml具塞刻度试管四支、滴管四支、収样器和塑料 直尺等。4、仪器设备高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇

19、床、离心机、电子天平等。四、实验操作步骤1、器皿的消毒:培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121°c f灭菌20 min,取出备用。2、培养基的配制与火菌培养基的组成为:rbv-淀粉(1.2 %, w/v), nano3(0.2%, w/v), k2hpo4( 0.2 %, w/v), mgso4-7h2o (0.1%, w/v) ,kcl(0.1%,w/v),琼脂(2%, w/v),调 ph 至 6.0 左右。在 三角瓶中，121°c灭菌20 min,将灭菌后的培养棊倒入培养皿，每皿大约15ml,静置凝 固备用。(倒平板之前务必将培养基摇

20、晃均匀，以避免标记的rbv淀粉在培养基中分 布不均匀，影响菌落的观察。)3、土样的采集及稀释于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样, 将从各个地点取得的土样混合；収样点最好选择有机质丰富的地方。4、富集称取5.0 g混合土样和0.5 g的淀粉混合，并加入适量的蒸憎水使其湿润，置于培养 皿中富集培养24h。5、菌种的初筛称取l.og步骤4所得的土样于灭菌貝塞刻度试管中，在超净工作台内(亦可使用酒 精灯，直接在实验台上完成)，加入无菌水至5ml,振荡后静置，待土壤颗粒沉降后， 取上层液lml转移至另一刻度试管中，加入9ml无菌水，摇匀：从第二支试管中取出 lml

21、转移至第三支刻度试管，加入9ml无菌水，摇匀；再从第三支试管小取出iml转 移至第四支刻度试管，加入9ml无菌水，摇匀。如此重复即得到稀释倍数分别10、100、 1000倍的土壤稀释液。用移液枪分別吸収稀释100和1000倍的样品液50卜山，加入至已凝固的培养基表面, 用涂抹棒涂布均匀。将涂过样的培养1ul倒宜放査，于30°c培养箱里培养，观察菌落透明 圈的出现情况。(一般30h后即可出现一些透明圈)。6、菌株的纯化于超净工作台内(亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成)用接种环挑取长势良好且 透明圈胃径与菌落肓径的比值较人的菌落于平板上划线分离，培养一定时间，进一步分 离能形成透明圈的

22、单菌落。并在斜而培养基中保存。图2平板划线分离法示意图五、结果处理与分析1、菌落产生透明水解圈的观察用玄尺分别于不同方向测量菌落和水解圈的肓径人小，求平均值，并计算透明水解圈 肓径与菌落肓径的比值。表1不同菌落产淀粉酶能力的比较。菌落编号 菌落直径（mm）透明圈直径透明圈直径/菌落 菌落形态特（mm）直径征2、侯选菌落的形态观察：观察并描述分离所得菌株的菌落形态，以大致了解产酶菌株属于那一类菌。3、你所用的涂布平板法或划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是请分析原因。六、注意事项1、进行无菌操作询，将接种所需用具放于台而恢架上，对超净工作台即周围环境进行 75%酒精喷雾，使灰尘沉降，打开紫外灯

23、照射灭菌30min,操作前，用75%酒精喷 手杀菌。（在本实验中省去此步）。2、操作应尽量靠里，在酒精灯的火焰旁工作。3、实验过程中避免说话、走动。4、每次涂板后涂布棒均要用火焰灼烧灭菌，冷却后再涂下一-块板。实验二、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离一、目的学习和掌握亲和层析法分离纯化酶的基木原理和方法。二、原理许多生物分子都具有能和菜些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性（分子间 通过某些次级键结合，如范徳华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。如： 臨和底物（包括晦的抑制剂、产物、辅臨及其底物的类似物）的结合，特界性的抗体 一抗原（包括病毎、细胞）、激素与其受体、载体蛋白的结合，基因与其互

24、补dna、 mrna及阻遏蛋白的结合，植物凝集索与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结介等。均 属于专一性而可逆的结合，这种分了z间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用 牛:物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“牛物专一吸附技 术”或“功能层析技术”。它具有分离快速，纯化效率高。特别是対于那些含量少，杂质 多，采用常规方法难于分离的生物活性分了，显示了独特的优越性。因此，亲和层析 技术己成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。磁性介质 被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优 点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与

25、其它固形物间的分离，尤其 是当待分离的液体样品含有具它固形物或粘度较大时。磁性亲和分离技术是将亲和吸 附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。溶菌酶（lysozyme, ec.3.2.17）广泛地存在于动物、植物和微生物中，其中鸡蛋清 中的含量较为丰富。鸡蛋清溶菌酶的相对分子质量为14.6 kd, iii 129个氨基酸残基组 成的单肽链蛋白，含有4个ss键，在中性及偏酸性条件下结构较为稳定。溶菌酚能 催化水解细菌细胞壁多糖的n乙酰胞壁酸和n乙酰葡萄糖胺之间的p-1, 4糖廿键， 几丁质（又称甲壳素）则是这类细胞壁多糖的类似物，因此可利用溶菌卿打甲壳素间 的特界结合來

26、分离纯化溶菌酶。三、材料、试剂及仪器1、材料新鲜鸡蛋清：取自市售的鸡蛋。亲和层析介质：儿丁质磁性凝胶介质（自制）。溶壁微球菌（micrococcus lysodeikticus） （sigma 公 uj ）2、试剂 05n hac :吸取18ml冰乙酸，定容至1000 ml。 10%的hac： i及取100ml冰乙酸，用蒸镉水定容至1000 mlo 0.2mol/l nahco3 溶液：称取 16.8g nahco3,溶解，定容到 looomlo 5mmol/l nahco3溶液（含 0.2 mol/lnacl）：先将 0.2mol/l nahco3 稀释 40 倍，再于每升溶液中加入nacl

27、 11.688go 5mmol/lnahco3 溶液（不含 nacl）：将 0.2mol/lnahco3 稀释 40 倍。 lommol/lnahcos 溶液:将 0.2mol/l nahco3 稀释 20 倍。 1/15 mol/l 磷酸缓冲液（ph6.2）： na2hpo312h2o 4.7752g, kh2po4 7.2576g,溶解, 定容至looomlo考马斯亮蓝g-250：称取100mg考马斯亮蓝溶于50ml 90%乙醇，加入85%磷酸100ml, 川蒸僻水定容至looornl,过滤。 2 mol/lnaoh :称取 80g 的 naoh 定容至 1000 ml。0.1 mol/l

28、 ph 7.8 磷酸缓冲液（内含 0.5mol/l nh4ac）：称取 32.78 g 的 na2hpo312h2o, 1.33 g 的 nahzpohzo, 38.54 g 的 nh4ac 溶解后，定容至 loooml.3、仪器分部收集器、分光光度计、恒温水浴器、悝流泵、电了天平、强力电动搅拌器、抽滤装 置。四、操作步骤（一）、鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离1. 亲和层析介质的再生和平衡：用34个床体积的5mmol/lnahco3 （含nacl）溶液淋 洗亲和层析介质即可。（若发现介质上有太多杂蛋白和一些微生物污染，可用0.5mlo/l 的naoh淋洗亲和层析进行在位清洗）2. 蛋清提取液的制备

29、:取一个新鲜鸡蛋的蛋清，用5mmol/lnahco3 （不含nacl）液 搅匀并稀释至400ml,双层尼龙布过滤，取滤液。（测定酶液总体积，并留1（）ml 样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。3. 酸和热变性：用10%的hac将稀释示蛋清的dh值调至4.5, 60°c水浴15分钟，双 层尼龙布过滤，取滤液，用2 mol/l的naoh将上清的ph值调冋至7.0 （边缓慢加 入naoh边搅拌，以免局部溶液ph值过高和将ph值调过头），（测定酶液总体积， 并留1.0 ml样品于塑料指形管中用于酶活性及蛋白含量的测定）。4. 开放吸附：向步骤3的上清液屮加入上述平衡好的磁性凝胶介

30、质，于烧杯屮用玻棒 缓慢搅拌30 min （见图l-l）o （尽量缓慢地搅拌，以免破碎凝胶颗粒）。在此步骤屮 溶菌他被亲和吸附到凝胶介质上。5. 介质的磁性i川收及洗涤：用带环型条纹鴉料外套的圆形铁氧体磁铁作为外磁场收集 亲和介质，此时介质被吸附于塑料外套的表面，取出塑料外套中的磁铁将吸附于塑料 外套的表面的介质悬浮丁 lommol/lnahcch溶液小，缓慢搅拌洗涤介质，磁性冋收， 如此洗涤介质2次（见图1 -2,3）。将洗涤后的介质装柱（测柱径及层析床的高度），再用ph 7.8 #0.5mol/lnh4ac的o.lmol/l磷酸钠盐缓冲液（以下称溶液b）洗涤至流 岀液的a28o<o.

31、o5时，再用lommol/lnahco3溶液20ml洗涤以替换柱子屮的溶液b, 以便下一步的洗脱操作。123图1鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和吸附分离1溶菌酶的开放吸附；2亲和介质的磁性收集；3介质的洗涤6. 洗脱:用0.15n hac溶液进行洗脱，流速控制在30ml/h左右，分部收集（4ml/管）， 分别测定a280nin （其对快速地监控蛋白的洗脱情况）和酶活性，收集活性部分即为 纯化酶，4£下保存备用。（测定酶液总体积）。因本步骤所得酶液的活性很高，故 应取部分酶液（如0.2ml）稀释10倍后再用于酶活性测定，而用于蛋白含量测定 时则不必稀释）。7. 用离心管保留粗提液，酸和热变性的酶

32、液，用刻度试管保留亲和层析后的酶液，放 置在4°c冰箱，均用于实验三的电泳分析。（二）、测定方法1. 溶菌酶活性的测定原理：山于溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波 长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表 示酶活性。具体方法为：将溶樂微球菌研磨并溶于0.1mol/l磷酸缓冲液（ph6.2）屮，使 其a450nm在0.6o9间。吸取上述底物悬浮液2.0ml于玻璃比色杯，然后加入0.05ml 酶液,用移液枪搅动迅速混匀，启动反应,测定lmin内a45onm的变化（用0.1mol/l 磷酸缓冲液调零，当盖上分光光度tl- 2-

33、3秒钟后开始用秒表计时并读数），每15s记 录一次读数。酶活力的计算：首先要自定义陆活性单位(u)。如定义在肖前测定条件下，使测定体系在450nm 波长下的吸光度每分钟下降0.01所需的酶量为1个酶活力单位(u)。酶液活力稀释倍数2. 蛋白含量的测定 用考马斯亮蓝g-250法分析溶液屮可溶性蛋口的含量。取50ul的 样品液加入2.5ml的考马斯亮蓝g-250溶液，摇匀，放k 5 min后，在595nm波长 下测定吸光度，并根据标准曲线计算出蛋白含量。(由标准曲线求得的回归方程为： 酚样蛋白含量：b (mg/ml) = 1.674 x a595nm - 0.0354)五、结果处理与分析1、绘制亲

34、和层析洗脱曲线。(参考下图格式绘制)700600soous3)1015202530管号（支）a280nin o ly$ozyme activity图2鸡蛋清溶菌酶的亲和层析(2.0x15 cm)流速：60 ml/h； 4.0 ml/管2、制作纯化表。对每个纯化步骤屮的酶样测定以f 3个指标： 单位体积酶样的活性:a (u/ml) = aa45o/ (1.0 min x 0.01 x 0.05 ml),即酶液活力。 酚样的蛋白含量：b (mg/ml)、 fw样总体积：c (ml)o由此即可制作如下纯化表：表1鸡蛋清溶菌酶纯化表纯化步骤总体积总蛋白 总活性 比活性回收率纯化倍数浓缩倍数(ml)(m

35、g)(u) (u/mg 蛋白) ()(x)(x)粗提液cibjxciai><ciai/bi10011酸、热变性c2b2xc232xc22/ b2h2/b2a?/ aiai><ciai / bi亲和层析c3t>3xc33xc3/ b33xc3a3 / b3a3/aiai><ciai/bi3、常见的酶活性表示方法有那些（如：u/ml酶液；u / mg protein; u/g干重或 鲜重；u/g酶粉 等）？它们各有什么含义，适用哪些场合？4、与一般介质相比磁性亲和介质有何优缺点？5、层析操作中如何更换缓冲液？6、如何保存介质？六、注意事项1、搅拌开放吸附时

36、，搅拌的速度不要太快，以免破坏介质，搅拌速度以能使介质 悬浮即可。2、装好层析柱后，应在介质的而上铺一张圆形的小滤纸片，以免在柱层析过程中 介质被液滴冲起。实验三、纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析一、目的了解醜（蛋白质）纯度鉴定的常用手段。掌握用sds-page法进行蛋白纯度鉴定。二、原理蛋口质纯度鉴定通常采用物理化学方法，如：电泳、hplc等。其中常用的电泳分 析方法有sds聚丙烯酰胺凝胶电泳（sdspage）、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （page）等。纯的蛋白质在一系列条件下进行电泳时，都将以单一的速度泳动，它的非 变性电泳图谱应只呈现一条染色带。hplc常用于多肽、蛋白质纯度鉴定，纯的蛋白

37、样 品在洗脱图谱上呈现岀单一的对称峰。三、材料、试剂1. 材料：实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶。2. 试 剂：溶壁微球菌（micrococcus lysodeikticus） （sigma 公司）、内烯酰胺（acr） 屮叉双丙烯酰胺（bis）、甘氨酸、琼脂、三疑甲基氨基卬烷（tris）、十二烷基碱酸 钠（sds）、疏基乙醇、漠酚兰、甘油、考马斯亮蓝r250、甲醇、冰乙酸等。 低分子最标准蛋白（上海生化研究所），（已处理好不必再加样品裂解液进行 处理！!）电泳试剂配制：（1）30%凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（acr）, 0.81 g甲叉双丙烯酰胺（bis）加水定容 至looml,过滤后置棕

38、色瓶中，于4°c保存备用。（2）电极缓冲液：tris 3.03 g, 甘氨酸 14.4 g , sds 1.0 g,溶解并定容至 loooml （ph 值约 8.3）。（3）1%琼脂糖溶液：lg琼脂+100ml电极缓冲液加热溶解。（4）样品裂解液（2x sds加样缓冲液）：10%sds :1.00 ml筑基乙醉：0.1ml浓缩胶buffer：0.5 ml水：0.15ml共：2.5ml甘油:0.5 ml2%澳酚兰：0.25ml（5）染色液：称考马斯亮蓝r-250 0.5g ,甲醇225 ml,冰乙酸50ml ,定容至500 ml。（6）脱色液：取冰乙酸75 ml,甲醇50 ml ,定容至1000ml。（7）分离胶缓冲液：取18.15 gtris溶解后,加6mol/l hci溶液4ml,调ph值至&8, 定容至100 mlo（8）浓缩胶缓冲液：uz 6.0 gtris溶解后，加6 mol/lhc1溶液8ml,调ph值至6.8,定 容至100 mlo（9）10%sds：取10g溶解后，定容到loomlo（10）1%过硫酸较：取o.lg溶解后，定容到10ml。（11） temed：分装。其它试剂： lmol/l naoh :称取 20g 的 naoh 定容至 500 ml。四、操作步骤1. 封琼脂糖：取加热溶解的1%琼脂糖溶液，用滴管加入两