化学发光免疫分析翻译

1、.化学发光免疫分析姓 名： 周金倩 学 号： 113138301 专 业： 环境科学 学 院：环境科学与安全工程学院 2009年第4号第28卷，分析化学的趋势化学发光免疫分析赵丽霞，孙俪，褚晓刚化学发光免疫分析（CLIA）有几种潜在的优势，并且已经在临床医学、生物分析和环境分析中应用。本文涵盖了CILIA在免疫学、CL标记及相关技术和固相材料中的应用和最新的进展。我们描述了CLIA的自动化、集成及小型化。我们评价了不同类型的CLIA系统并且预测了它未来的发展方向。关键词：生物分析，化学发光免疫分析，化学发光标记，环境分析，免疫学，标记，制药分析，毒理学分析1. 导论由于免疫分析（IA）具有高灵

2、敏度、高选择性、快速检测和不用广泛的治愈就能分析困难的矩阵等优点，因而被广泛应用于制药分析、毒物分析、生物分析、临床医学和环境分析中。1959年，雅洛和博森1用125I 作为标记元素，继而放射免疫法（RIA）被发明。虽然RIA方法可靠并精确，但是这种方法在放射性同位素方面的应用还不是很好，放射性同位素限制这种方法必须施用专门的标记物。并且125I的半衰期较短2,3，这也限制了放射免疫法的普及。酶联免疫分析方法（ELISAs）比RIA更安全、更容易，因而应用比较广泛。ELISA是以比色、荧光和化学发光（CL）检测为基础的检测方法。然而，传统的比色法检测的灵敏度相对较低4。IA具有非常高的检测灵敏

3、度5,6，因而被应用于检测方法中，这种方法依靠的是特异性抗体（Abs）的亲和力和检测方法的灵敏度。在检测方法中，CL检测方法是在生物技术领域应用范围较广的一个多功能的、超灵敏的工具。CL方法替代了放射性的方法，与IA的检测原理相结合用于检测分子（如蛋白质、激素、药物、核酸和环境污染物等）。现在，CL经常以一个CL标记物的形式或以一种酶或纳米粒子（NP）的检测反应的形式用于IA方法中。近年来，由于CLIA具有高灵敏度、宽的动态范围和完整的自动化等优点，已被广泛的应用于临床医学和环境分析中。随着重组抗体（rAb）技术、标记和相关技术、固相材料、自动化的技术改进、集成化和小型化技术的应用和发展，CL

4、IA已经获得一个全新的改观。2.免疫识别在过去，多克隆和单克隆Abs(pAbs和mAbs)一直主导着IA，并且以后也会继续7。传统上，Abs可以从超免疫动物和杂交瘤细胞中获得。迄今为止，表展示了rAbs在很多动物体内提取（如兔子、羊、鸡和牛），这种提取方法相对比较便宜且提取量比较大，但是这种提取方法会掺杂着结构相似的化合物和共存污染物，共存污染物用于分析以pAb为基础的检测基质效应。虽然mAbs通常由小鼠体内提取8，但是它们拥有特异性结合的特点，并且是基于单克隆抗体的检测，比基于pAb为基础的检测更为敏感。生产单克隆抗体的主要缺点是它们很昂贵并且产生和维持一个杂交瘤细胞株9要求的技术水平比较高

5、。动物的免疫反应可以预先确定单克隆抗体的结合特性并且在蛋白质水平上很难修改10。然而，由于表达抗体片段的分子方法和生产及筛选组合库技术的发展，目前已经开辟了一个比较宽的用于选择和设计rAbs的机会11。rAbs不需要结合骨髓瘤细胞就可以从各种动物体内提取。从动物体内提取的抗体基因能够通过聚合酶链反应（PCR）而扩增，并能以各种形式在不同的表达系统中被表达。例如：片段，抗原结合（Fab），片段，变量区域（Fv），单链Fv（scFv）和单域的重链可变区片段（VHH），从骆驼体内提取的重链Abs（HCAbs）如图1。分析物 抗体片段 参考文献阿特拉津 杂交瘤细胞的Fabs 12毒死蜱-乙基 杂交瘤细

6、胞的单链抗体可变区域片段 13多氯联苯 杂交瘤细胞的Fabs 14细胞表面蛋白质 人的重组体单链抗体可变区域片段 15二恶英（2，3，7，8-TCDD） 杂交瘤细胞的Fab 16fPSA, fhK2, thK2 重组的Fab 17克伦特罗-激动剂 杂交瘤细胞的单链抗体可变区域片段 18伏马菌素B1 杂交瘤细胞的单链抗体可变区域片段 19甲胺磷 小鼠的单链抗体可变区域片段 20软骨藻酸 羊的单链抗体可变区域片段 21fPSA（自由的前列腺特异性抗原）；fhK2(自由的人体激肽释放酶2)；thK2(总的人体激肽释放酶)表1. 用于免疫分析的重组抗体这些抗体片段有三个主要的有点：（1） 它们的体积比

7、较小，因此更容易操纵基因并在细菌体内表达。（2） 它们可以被表达并作为融合蛋白在噬菌体表面被（3） 显示时，它们保留亲和选择的功能。 天然抗体 重组抗体片段 图1. 传统的抗体分子的结构及其不同的重组形式10 因此，就生产方面来说，rAbs为传统的mAbs或pAbs提供了优势，增加了保留选择性和多功能性的优点。从大噬菌体体内提取生产和选择抗体片段已成为一个常用生产特定的Abs的方法。当Abs被用来抵抗小的，无免疫原性的分子（半抗原）或剧毒物质时，这种技术就特别的有价值。此外，半抗原经常结合蛋白质载体一起承担自由半抗原不被检出的风险。Pan等18利用噬菌体显示技术来生产直接抵抗-受体（克伦特罗）

8、的单链抗体。噬菌体的单链抗体可变区基因片段（scFv）通过卵清蛋白链的结合而放大。在酶联反应中，scFv和mAb母链（IC50为1.34±0.006ng/mL(n=4)）相比呈现出了比较高的灵敏度（IC50为0.78±0.005ng/mL(n=4)）。劳尔等19生产了单链抗体用于抵抗高毒性的霉菌毒素伏马菌素B1，并把半抗原通过一个连接器与生物素耦合。利用这种共轭和单链抗体库，它可能需要免疫并伪装成半抗原。肖等21描述了rAbs抵抗贝类毒素和软骨藻酸的过程，用羊的免疫系统作为一种生产高亲和力的抗半抗原rAb片段的方法。此外，植物和作物品种可以生产廉价和有效的Abs22。对于实

9、际样品的测定，通过有机共溶剂在水溶液中溶解疏水分析物来形成Abs的变性作用是一个比较困难的问题，Abs可以结合具体的目标分子，因此，设计和合成仿生的Abs是一个长远的目标。在过去的几年中，在免疫分析中分子印迹聚合物（MIPs）替代Abs已引起了关注（例如，结合实验，生物传传感器和固相免疫物质23拥有选择性，易于生产，低价格和较好的物理和化学的稳定性）。对于免疫分析来说，表2列出了在免疫分析中用MIPS代替Abs。虽然据报道在15年前24MIPs就用来替代Abs，但是目前还没有以MIP为基础的检测，部分原因可能是MIPs和许多现代化的IA的兼容性仍需要证明28。分析物 MIP聚合物的配制 免疫形

10、式 参考文献阿特拉津 MAA+EGDMA+AMVN 竞争 25肾上腺素 APBA+（NH4）2S2O8 竞争 26荧光素和二氯苯氧基乙酸 4-VP+TRIM+DPAP 竞争 27二氯苯氧基乙酸 4-VP+TRIM+AIBN 竞争 28,2二氯苯氧基乙酸 4-VP+EGDMA 29谷氨酸 被处理的硅烷氧化铝膜所修饰的醛基（纳米线） 30MAA（甲基丙酸烯）；EGDMA（乙二醇二甲基）；APBA(3-氨基酸)；AMVN（2,2-偶氮双(2,4-偶氮二异庚腈)）4-VP（4-乙烯基吡啶）；TRIM（三羟甲基丙烷 三甲基冰乙酸酯）；DPAP（2,2-二甲氧基-2-苯基）；AIBN（2,2-偶氮双-异丁

11、腈）表2 在化学发光免疫分析中用分子印迹聚合物（MIP）取代抗体的报告3. 标记物反应生成的发光试剂可以附着在Abs或抗原（Ags）上并作为免疫反应的标记物。自从1976年首次报告了发光标记物，由于发光标记系统的检测限32很低，所以研究这类系统需要相当大的努力。在CLIA方法的应用和发展中鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）经常被用来作为CLIA的标记物。因为发光的检测方法有非常低的检测限，全新的发光标记物及其衍生物和新的标记技术已经取得了惊人的研究成果。在本节中，我们根据近几年的研究把发光标记物分为两类并重新探讨它们。在反应中，一类标记物被消耗掉

12、，其它的标记物没有被消耗而是以光的形式释放出来。3.1被消耗的标记物 这种标记物在发光反应中被消耗掉（如鲁米诺衍生物，吖啶酯和纳米颗粒）。 鲁米诺是最有名的和最有效的发光试剂之一，它是通过和氨基的反应形成耦合配体。然而，由此产生的共轭效应比母体混合物的发光效率低。用鲁米诺作为标记物取得了较大的成功。 当芳香吖啶酯类化合物在发光反应中被过氧化氢氧化时，Abs和银的衍生物就能以高灵敏度被检测出来。这类标记物的性能和鲁米诺相似，因此一直努力去评估适合耦合和选择氧化试剂（用来提供最低的检测限）的鲁米诺或吖啶酯衍生物在发光反应中的效果。陈等33合成了一个新的双吖啶化合物10，10-二甲基-3，3-二磺酸

13、-9，9-双吖啶作为发光标记物并建立一个夹层的CLIA方法，该方法用于测定人体血清中的癌胎抗原（CEA），校准范围为1.0-100ng/mL和CEA的最小检出浓度为0.53ng/mL.当BMDSBA接触反CEA抗体时，在免疫反应中的标记物CEA和DMDSBA的量子效率都没有明显变化。当BMDSBA接触反CEA抗体时，在免疫反应中被标记的反CEA抗体和DMDSBA的效率都没有明显的改变。被标记的平均比例为1.25。Scorilas等34合成了两个新的生物素吖啶衍生物，9-（2-生物素-乙氧基）-羧酸盐-10-甲基吖啶三氟（BOCMAT）和9-（2-生物素-己醇胺）-羧酸-10-甲基吖啶三氟（BA

14、CMAT），并描述了它们的发光性能和IA方法的应用。在极性非质子溶剂中，这种新的试剂的CL效率很高，它的检测限下降到了7.28×108mol/L。这种新的化合物被用来检测老鼠体内的免疫球蛋白lgG。然而，这些作为标记物发光试剂的检测方法的灵敏度和稳定性是不理想的35。最近，用纳米粒子（尤其是金属纳米粒子）作为生物标记物的方法已经吸引了人们的广大关注。纳米粒子作为生物标记物呈现出很多的优点36-38。首先，很多在纳米尺寸里有独特性能的纳米结构都很容易准备，因此，它们在生物技术系统中的应用已经引起了人们的广泛关注。其次，纳米粒子比较适合在生物系统中共轭，因为它们有很好的生物相容性并对于许

15、多微生物分子都有类似的尺寸范围。近年来，很多不同的纳米粒子在CLIAs方法中作标记物用于检测分析。表339-47显示了作为标记物的不同种类的纳米粒子和在IA检测系统中相应的发光试剂。当用Au纳米粒子作为发光标记物时，这个系统经常会以敏感的Au3+催化鲁米诺的化学反应39，41，43，47为基础。Au3+是是金粒子束缚于抗体或Ag的溶解产品，它用于发光反应中的间接测量抗体或Ag。分析物 纳米粒子 分析形式 检测系统 检测限 文献hlgG 金 夹心模式 AuCl4-Luminol-H2O2 1.5ng/mL 39,43 3.1×10-12MDNA 银 夹心模式 Ag+Mn2+K2S2O8

16、H3PO4Luminol 5fM 40胸膜肺炎放线 金 间接测量 AuCl4-HClNaClBr2Luminol 41杆菌毒素抗体 mlgG 金-汞 间接夹心 CCD 0.1ug/mL 42hlgG 金-汞 夹心模式 Ag+K2S2O8Mn2+H3PO4Luminol 0.005ng/mL 44DNA, hlgG 不规则的金 夹心模式 AuLuminolH2O2 13pmol/L(DNA) 45人体前清蛋白 CdSe ECL(CdSeK2S2O8) 1.0×10-11g/mol 46（PAB）DNA 金 夹心模式 AuCl4-LuminolH2O2 0.1pM 47表3.在化学发光免

17、疫分析中用纳米粒子（NPS）作为标记物的报告在一个IA模式中，李等39探讨了金粒子作为发光标记物检测人体内的免疫球蛋白lgG、羊-抗-人的lgG和兔-抗-山羊的lgG。人类的lgG首次被用于在Ag中固定成固定相。之后Ag会用于捕获羊-抗-人的lgG抗体，这类抗体会接着捕捉用Au粒子标记的兔-抗-山羊抗体。Au粒子被固相吸收后会溶解在Aucl4-中，在发光反应中，Aucl4-对鲁米诺-H2O2有强烈的催化效果。Aucl4-鲁米诺-H2O2的发光信号被测量并用于检测免疫反应中山羊-反-人的lgG。它的发光强度是和山羊-抗-人的lgG的浓度对数成正比的（在0.005-10lg/mL，最低检测限为1.

18、5ng/mL）。从分析化学的角度看，这种反应在许多IA和DNA的杂交的应用中是相当有前景的43。两年后，李等47开发了一个以相同的夹心模型和Au为标记物为基础的用于DNA杂交的CLIA的方法。Au粒子被烷基硫醇寡核苷酸链改性用来作为探针来监测具体的目标DNA的存在。Aucl4-是Au粒子锚定DNA杂交的溶解产物，在H2O2-鲁米诺-AuCl4-发光反应中，它用来分析间接测量的目标DNA。包含大量从每个杂交DNA释放出来的AuCl4-的发光分析有卓越的灵敏度，并且它的允许检测限可低至目标DNA的0.1pM。韩等41报道了以金离子增强鲁米诺的发光反应的CLIA方法用来检测胸膜肺炎放线杆菌（APP）

19、的ApxIV抗体。纯化的重组ApxIV蛋白质被吸收在聚苯乙烯的表面。血清样品中的重组ApxIv蛋白捕获，接着被共轭的金粒子-兔-抗猪的lgG夹在中间。接着，未被绑定的共轭金粒子-兔-抗猪的lgG被消除。在一个HCl-NaCl-Br2氧化反应中，在聚苯乙烯表面锚定的金粒子释放出大量的AuCl4-，然后，由一个简单的、敏感的AuCl4增强鲁米诺发光反应来定量。在最佳条件下，获得发光光子计数和血清稀释系数之间的良好相关性，血清稀释的范围为1：160-1：40000。在比较间接血凝试验（IHA）和ELISA时，CLIA方法比较可靠和实用。王等45合成了形状特殊、不规则的金粒子并发现它们在鲁米诺发光反应

20、的催化效率是球形金粒子催化鲁米诺发光效率的100倍。使用不规则的金粒子官能DNA低聚物和不规则的金粒子改性抗-lgG作为原位发光探针，建立一个夹心型分析方法，这类探针用来快速、简单、选择性和敏感的检测DNA特定序列和检测发光反应中人类的血浆lgG。金属发光免疫学还开发了用银粒子标记来超灵敏的检测杂交DNA40或用银沉淀标记胶体金用于敏感的检测hIlG44。银纳米粒子在硝酸中被溶解成Ag+，接着被一个联合的化学发光反应系统（Ag+-Mn2+-K2S2O8-H3PO4）灵敏的检测。这种灵敏的发光方法结合这大量的从每个杂交生物体中释放的Ag+,这种发光方法允许特定序列DNA的检测水平是5fM，人体内

21、的lgG的检测限是0.005ng/mL。高荧光量子点（量子点）已经受到了极大的关注。大小可调的窄的发射光谱已经被广泛应用与生物发光应标记中48,49。Jie等46描述了一种电化学发光（ECL）免疫反应，这种反应是以CdSe量子点为基础测量人体内的前清蛋白（PAB）。ECL的检测原理（如图2）是由CdSe量子点和K2S2O8产生的ECL反应抑制了免疫复合物，这个过程降低了ECL反应的强度。PAB的浓度范围在5.0×10-10-1.0×10-6，检测限为1.0×10-11。图2.纳米粒子的电化学机制463.2没有被消耗的标记物 这类发光标记物不被消耗但是可以催化光的产

22、生。它主要包括酶标记物例如，碱性磷酸酶（AP）50，b-D-半乳糖甘酶和辣根过氧化物酶（HRP）51。这些标记物需要适合的基质。为了获得一个低的检测限，高度敏感的发光检测系统已经可以用于检测CLIA标记物。HPR是一个比较常用的标记物，这中用于检测HPRs的快速、敏感的方法在几个化学发光系统中都是可行的。HPR有一个阳离子同工酶-c（HRP-C），它是辣根纯化的过氧化物酶。它催化由一个氢受体（氧化剂）（例如，过氧化氢或过氧化脲）和氢供体之间的荧光反应，包括发光基质（例如，鲁米诺）。这一反应可以在近分钟之后迅速消失。但是它的敏感性和发光平台限制了CLIA的应用，因此有很多关于促进剂和稳定添加剂的

23、研究，这些研究是为了提供CLIA反应的强度和延长并稳定它的发光时间。4-碘苯酚（PIP）52是最著名的HRP催化鲁米诺氧化发光的增强剂。 对于鲁米诺-H2O2-HRP系统，罗等53描述了苯基片段和四苯硼钠的协同反应，这种反应能提高系统的灵敏度。此外，大量取代酚的物质如，萤火虫的荧光素，6-羟基苯并噻唑衍生物和取代苯硼酸衍生物（如，4-碘苯硼酸或更复杂的）已经被用为增强鲁米诺信号的增强剂54。 Dotsikas54，55等发展并比较了几种不同的鲁米诺信号增强剂即4-甲氧基苯酚（4-MEP），4-（1-咪唑基）苯酚（4-IMP），4-碘苯酚（4-IOP），4-羟基联苯（4-BIP），4-（1H-吡

24、咯-1-基）苯酚（4-PYP）用于一个实验中检测芬太尼的发光异构酶免疫分析。结果表明，每个苯酚增强剂的化学发光强度，检测限和发光动力学的轮廓相对于不同的取代基是不同的。这可能是由于取代物质的电子属性（即共振效果的强度）对激发的稳定度有着至关重要的作用，因此它对化学发光强度的提高也起着关键的作用。此外，电子基团对OH键理解能有着相似的作用（减少），因此使芬氧自由基56，57得到稳定。芬氧自由基可以影响鲁米诺的化学发光强度。另一方面，从不同植物体内分离出来的阴离子过氧化物酶例如，非洲油棕榈树的叶子（AOPTP）58，大豆的皮（SbP）59，60已经被研究。结果表明，阴离子过氧化物酶可以在没有任何增

25、强剂的情况下可以有效的催化鲁米诺-过氧化氢的化学发光。此外，这种过氧化物酶可以使鲁米诺氧化形成一个长期的化学发光信号。因此，这一事实让我们期待着不使用增强剂和稳定添加剂就可以产生高度敏感的化学发光免疫试剂盒的新进展。4. 固相物质常用的固相物质是用聚苯乙烯准备形成的96-微量点滴板。由于免疫分析的目的，微孔板被捕获蛋白61-63预涂就像抗体被固定待测一样。然而，在塑料表面直接的吸附Abs可能对实验的表现产生不利的影响，例如重现性、灵敏度和成本等。赵等64开发了两种不同的以生物素-亲和素系统和荧光素异硫氰酸盐（FITC）-抗-FITC系统为基础的固相，用于检测尿清蛋白。亲和素或抗-FITC抗体被

26、涂在微孔板上，为了提供一个普遍的能够改进变异性和敏感性的固相。对于两相间的线性范围和白蛋白的检测限是0.15-15ug/mL和0.089ug/mL。随后，林等65，66使用FITC-抗FITC系统作为固相和生物素-链亲和素系统作为信号放大系统来发展一个高度敏感的CLIA方法，这个方法可以检测17-雌二醇（E2）和人体甲状腺激素（hTSH），它的检出限分别为1.5pg/mL和0.01mU/L。 磁性微球有很多超过固相微孔板的优点。例如，微球可以提供一个比较大的面积，它允许使用高浓度的捕获Abs，它可以增强检测的灵敏度；抗体-涂层微球是自由悬浮在含银的环境中并更快速的反应速率的效果，同时减少了混合

27、搅拌的时间。包含银抗体复合物的微球的分离比较容易并能在一个简单的磁场内快速的反应；免疫磁性微球能够从大量的、稀有的样品中捕捉少量的分析物。因此，当磁性微球被收集时，分析物的总量就可以有效的被集中。表4列出了在CLIA中用作固相的磁性粒子。林等68-72使用磁珠作为第二抗体分离剂和第一抗体固体表面来发展高灵敏度的化学发光免疫分析方法用来高效、特异、快速和可重复性的检测人体内的雌三醇（E3）、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原50（CA50）。赵等73-75开发了一个通过连接微孔板和磁珠作为固相来检测人体血清和唾液中的绒毛膜促性腺激素（HCG）的微型磁钢板化学发光免疫酶。对于环境样品

28、中的17-雌二醇，他们用自己设计的微型钢板磁选机，这个机器可以不用对样品进行预先处理就可以实现高通量分析。淡水和海洋沉淀物中可以分理处磁性细菌并且可以产生磁性微粒77，78。许多研究已经研究了这些磁性粒子的功能和体内导航罗盘的机制。细菌的磁性粒子（BMPs）的体积非常小（50-100nm）并且分散性非常好，因为它们被一个稳定的脂质膜覆盖。用双功能的试剂和戊二醛把酶和抗体固定到细菌磁性粒子上比把它们固定到人工磁性粒子上来说有比较多的运动。松永等79-81开发了一个使用固定在BMPs上的抗体来测定小鼠免疫球蛋白G（lgG）、E2、烷基酚聚氧乙烯醚（APES）、双酚A（BPA）和水中的直链烷基苯磺酸

29、盐（LASS）来对化学发光进行环境影响评价。为了避免通过共价化学交联把抗体固定到BMP上的需要，从转化结合子AMB-1中产生的A-BMP蛋白复合物可以被A蛋白质的Z区域和来自抗体蛋白A-BMP复合物85的免疫球蛋白的Fc部分复杂化。这类复合物有好的分散性因此在免疫分析中能够产生高效的信号和低噪音。陆等86介绍了聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIP）和作为双分子固定运输的磁珠，这些磁珠可以通过把抗体固定到磁珠和PNIP的表面，从而利用非竞争ELISA的热反应的优点来分离不同的目标物质。此外，高灵敏度的HRP发光检测已经被应用，并且它的lgG和lgA的检测限可以低至2.0和1.5ng/mL。分析物

30、固相 化学发光系统 检测限 文献E3 磁性粒子 (MPs) 0.6 ng/mL 68AFP 磁性粒子 ALPAMPPD 3.0 ng/mL 70CEA 磁性粒子 ALPAMPPD 0.69 ng/mL 71CA50 磁性粒子 ALPAMPPD 1.0 U/mL 72HCG 磁性粒子 ALPAMPPD 0.15 mIU/mL 73E2 磁性粒子 ALPAMPPD 5.4 pg/mL 74mIgG 小鼠骨形成蛋白 鲁米诺-磷酸盐 530ALP 1 fg/mL 79E2, APEs, 小鼠骨形成蛋白 鲁米诺-磷酸盐 530ALP 20 ppt, 6.6 ppb,BPA, LASs 2.3 ppt,

31、35 ppt 80,81LAS, 烷基酚 磁珠 鲁米诺过氧化氢HRPPIP25 ppb, 10 ppb, 2 ng/mL 8284聚氧乙烯醚 (APnEOs),卵黄蛋白原 (Vg)胰岛素 A-BMP蛋白复合物 鲁米诺-磷酸盐 530ALP 2 uU/mL 82表4. 化学发光免疫分析（CLIA）中作为固相的磁性粒子的发展5. 与其它技术的结合5.1 流动注射化学发光分析拥有流动注射分析（FIA）和免疫分析的所有优点，即高灵敏度、高准确度、高速度和高选择性53。由于这种技术消耗比较少的样品、减少了样品的处理、可重用性、较好的重现性、比较短的时间和易于采样的自动化等优点，它已经被广泛应用于环境监测

32、、食品安全、药物分析和临床诊断87-89等领域中。这种技术可以在同构和异构系统中进行。在异构的流动注射免疫分析中，在银抗体复合物的形成过程中可以产生信号。异构检测比较适合于流动注射免疫分析（FIIA），因为它的分离步骤可以在FIIA系统90中在线执行。分离步骤在固定床反应器中进行。因此，选择一个合适的、稳固支持的反应器是比较重要的。最常用支持物质包括珠材料、琼脂、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯和磁性粒子或膜。异构FIIA系统支持一个多通道的蠕动泵、注射阀、免疫反应柱和检测器。图3显示的是在交联壳聚糖膜91上固定的CA19-9为基础的碳水化合物银19-9（CA19-9）的流动注射化学发光免疫分析器。经过分

33、析物CA19-9和被抗CA19-9标记的HRP的脱线孵化，混合物被注射到免疫反应器中，这可以引起在免疫分析器中捕获自由的被抗-CA19-9（通过银的固定）标记的HRP。由于鲁米诺和过氧化氢的催化反应，被标记的HRP抗体可以被化学发光分析方法检测到。在最佳条件下，免疫分析器的化学发光信号是与CA19-9的浓度（浓度范围是2.0-25U/mL，检测限是1.0U/mL）成正比的。采用相同的CLIA流动注射方法，由环氧烷修改的玻璃微珠、琼脂糖凝胶93和羧酸树脂94组成不同类别的免疫反应器被应用于临床分析物的检测。图3. 非竞争性流动注射化学发光免疫分析系统：P，蠕动泵；V，八通阀；IMS，免疫器；PM

34、T，光电倍增管；D，检测器91。图4. 磁珠的顺序喷射系统Ruzicka和Marshall95介绍了FIA的新变化即顺序注射分析（SIA），它已经被应用与CLIA96中。与FIA不同，SIA包含一个多位置连接的凸轮驱动的正弦流量柱塞泵，利用这个泵，物质可以按顺序被吸入单一的反应通道。Imato等97，98开发了以磁性微球的SIA为基础的一种快速、灵敏的免疫分析方法，用于检测直链烷基苯磺酸盐（LASS）和烷基酚聚氧基（APnEOs）（如图4）。流动池的磁珠的控制、捕获和释放都是通过钕磁铁的控制和调整载体溶液的流动来实现的。这类免疫分析是由一个在磁珠上的抗-LAS（或抗APnEO）单克隆抗体和LA

35、S（或APnEO）样品和被LAS（或APnEO）标记的HRP引导的一个间接竞争免疫分析为基础的，随后，又以在鲁米诺反应中HRP与过氧化氢和-碘苯酚产生的发光反应为基础的。在最佳条件下，进行分析的时间不少于15分钟。5.2 毛细管电泳法 毛细管电泳免疫分析（CEIA）结合了CE的有效分离能力和IA的配体特异性，这种分析方法被证明是一个强大的生物化合物99的分离和分析的技术。与传统的免疫分析技术相比，CEIA拥有高效率、少的样本、分析时间短和易于自动化的优点。它已成功的用于检测某些肿瘤标记物、激素和滥用的药物例如，人体生长激素（hGH）、胰岛素、吗啡、皮质醇和地高辛100，101。 在过去的十年里

36、，CE与CL的结合研究已经取得了较快的进展，这种结合技术拥有灵敏度高、操作简便和试剂102廉价、易于制备的优点。人们已经资助了它在CEIA中的应用。Tsukagoshi等103证明了在CE方法中，利用小鼠的免疫球蛋白和被抗-鼠免疫球袋白抗体标记的HRP在一个新设计的间歇式免疫反应检测细胞的CEIA实验。王等104以增强化学发光检测为基础，利用CEIA的非竞争模式成功检测出在大鼠血管平滑肌细胞（VSM）中的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）。HRP-Ab2-mAb-BMP-2复合体和自由的HRP被基线分离，HRP在检测限为4.4×10-12mol/L(53zmol)被检测出来，BMP-2

37、在检测限为6.2×10-12（75zmol）时被检测出。吉等105开发了一个血清数量有限的情况下，以被CLB标记的HRP和自由的CLB之间的竞争反应为基础的用免疫分析检测CLB的CEIA方法。在最佳条件下，CLB-HRP示踪体和免疫分析复合体被分离，分离时的线性范围和CLB的检测限是5.0-40nmol/L和1.2nmol/L。以CL为基础的CEIA成功的应用于检测肿瘤抗原CA125106、乙肝表面抗原（HBsAg）和人类血清中的抗体（HBsAb）107。5.3 芯片毛细管电泳法利用芯片毛细管电泳法作为光检测（LIF和CL）的分离方法为基础的微型免疫分析方法已经被报道108-110，

38、它具有重现性好和反应时间短等优点。然而，被荧光燃料标记的抗体在毛细管电泳中被观察，由于抗体本身具有电荷异质性111，这种性质减少了信噪比的检测限。Tsukagoshi等112开发了一个微型全分析系统（l-TAS），把这个系统纳入用于肿瘤标志物的化学发光检测。分析系统在一个芯片上进行了以下三个过程：高选择性的免疫反应，用于样品插入的形成和运输的化学发光检测，高灵敏度的化学发光检测。这三个过程都是在芯片上进行的，图5显示了l-TAS系统。这个微芯片包含两个微通道，这两个通道在一个路口横过，并以四个聚水池的微通道结束。在第一个过程中，免疫反应利用抗体固定的玻璃珠。在一个聚水池中，这个玻璃珠和银（分析

39、）和一个已知量的用银标记的ILITC一起建立了一个竞争激烈的免疫反应。电泳分离法是第二个反应过程，在样品塞中产生交集的电泳可以提供免疫反应的反应物。然后，这个样品被移动到另一个含有双氧水的水库。此时，化学发光检测作为第三过程：被标记的银混合着过氧化氢和在迁移缓冲区的催化剂反应产生化学发光。CL被蓄水池下面的一个光电倍增管检测。这里描述的L-TAS是能够确定的、具有高选择性和高灵敏度的技术，人体血清蛋白或免疫抑制酸性蛋白作为人体血清中的肿瘤标志物。图5. 结合免疫法和化学发光检测的全微分分析系统112Emneus等113使用硅微芯片作为一个模型，把它纳入一个微酶IAs中，以涂有硅的抗体微芯片为基

40、础并利用HRP标记物的增强的FI-CL检测来分析鲁米诺-过氧化氢-p-碘苯酚反应。如图6显示，多克隆Abs被连接在硅微芯片的表面，它的检测原理是以一个直接竞争的异构模式为基础，在这个模式中分析物和酶标记的阿特拉津（示踪剂）为了固定的抗体结合位点而竞争，通过示踪剂的分离和检测，直接在芯片上形成化学发光信号。图6. （a）微流控酶免疫法。注射泵和蠕动泵分别用于载波缓冲区和再生缓冲区。 在一个六口喷射阀进样。光电倍增管置在流动的细胞上，细胞上包含固定抗体的硅芯片，发光时的化学发光信号被光电倍增管测量。（b）有机玻璃芯片流通池。（c）微芯片旁边有一把尺子和一个用于放大图片的平行网络渠道。5.4 连接技

41、术的挑战 各种IA技术的发展是由生物、环境、临床或医学领域的需要而推进的。显然，生物样品（例如，唾液、血浆、人血清、脑脊髓液和活检标本）包含着重要疾病的生物学标志物或一个复杂的样品基质中的蛋白质，其中每分钟内Ag的浓度和动态都必须考虑进去。目前用于检测临床或环境中重要的Ags的新兴技术有非常好的检测限，这个检测限接近一个阿莫尔水平并且能够同时确定多个分析物。而且它还显著朝着微型化、自动化、成本效益和多重分析的趋势发展。因此，微流体IA设备具有高表面积比和nL容量的优点。然而，由于CLIA里面有一个微通道，在这里的Ags和Abs被电动或压力驱动流驱动进行交付，因此芯片-CE-CLIA技术已经受到

42、限制。被驱动的泵、阀和混合器是目前的主要进步。这并不奇怪，因为它使流体控制能够较容易的消除其它宏观的运动成分的影响，最终实现成本效益的微芯片。现在，微流体IA芯片的制作正在迅速迈向一个简单的，便携式的点-医疗诊断设备，这个设备通过各种各样的趋势实现，如使用高分子材料、被动的流体控制和芯片的检测点等。此外，磁微粒和纳米粒子的组合被证明是一个比较适合的组合，它不仅有信号增强的功能，还缓解了流体操作中磁场的存在，尤其是在微流体IA中。6 展望在分析化学中的显著趋势已经朝着微型化，灵敏度和多重分析的提高而发展。现在已经开发了小型化的CL反应器、高密度的反应管和以分析仪为基础的微芯片，这些都需要极少的样

43、品和试剂114。随着以微阵列为基础的分析设备的可用，高检测性和快速的CL技术使高吞吐量的筛选实验得到发展，在这同时，在混合样品中的多个分析物都可以被检测出来。分析灵敏度的改善将有可能发现环境污染或疾病检测中新的分析物。通过使用NPs作为标记物和CL检测方法39-47，技术的提高能够保证在血清中的有极低的检测浓度。寡核苷酸和NPs的结合有较特殊的发展。使用这些非常小的颗粒可以拥有一个高的灵敏度。张等115使用Au和CuS作为标记物和CL检测方法用于DNA的检测，这种方法的灵敏度比其它方法高6倍。使用这个免疫NP检测能够检测出在10uL被检测液中的18-20个 -甲胎蛋白分子，比传统的IA116高

44、6-log倍。 多重分析可以同时测量许多被分组的分析物。基于传统的CLIA程序，在微芯片上的多因素分析已经被用来检测多分析物。在这个分析技术中，不同的半抗原或Abs被固定在玻璃表面的不同领域。通过光输出空间格局的分析和测量来自电荷耦合器件（CCD）的成像来检测不同的分析物117。最近研究出了平行的亲和力传感器检测技术（PASA），这种技术是利用自动的芯片-多分析物免疫分析方法，这个方法拥有间接竞争的ELISA模式和被一个电荷耦合摄像机（CCD）监视的CL反应，这个方法能够同时检测牛奶中的抗生素118并通过使用小型化的微芯片制造技术，使兼并CL检测功能的CE分离系统得到发展。致谢我们感谢来自中国

45、科学院重大科研和发展项目（YZ-0632），国家重点技术研发项目（2006BAF07B03-1-1）和中科院研究生创新基金（No.YXLW3）的财政支持。参考文献1 S.A. Berson, R.S. Yalow, Nature (London) 184(1959) 1648.2 I. Suruglu, J. Svitel, L. Ye, K.Haupt, B. Danielsson, Anal. Chem. 73 (2001) 4388.3 Z.P. Li, Y.C. Wang, C.H. Liu, Y.K. Li, Anal. Chim. Acta 551 (2005) 85.4 C.A.

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