NK细胞培养SOP

1、细胞培养产品专家北京同立海源生物科技有限公司NK细胞培养sop日程：第0天：NK激活剂的处理，分血第2天：补液20ml第4天：补液第7天：装袋第9天：补液第11天：分袋第13天：检菌第14、15天：收获1. 研究背景与目的采用从病人自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使其扩增活化，再静脉回输，将其输回病人体内，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗 方法。2. 定义和缩写2.1.NK自然杀伤细胞2.2.rhIL-15 人源重组白细胞介素152.3.IL-2白细胞介素3. 主要仪器、耗材,.1.仪器3.1.1生物安全柜3.1.2流式细胞仪3.1.3水平低速离心

2、机3.1.4火菌锅3.1.5CO 2孵箱3.1.6倒置显微镜3.1.7血细胞记数器3.1.8血细胞计数板3.1.9移液器3.1.10 -20 C -4C冰箱3.2. 耗材3.2.1 75cm2 培养瓶3.2.2 225 cm2 培养瓶3.2.3 移液管3.2.4 15ml、50ml 离心管、250ml 离心管3.2.5医用塑胶手套3.2.6 一次性帽子、手套3.3. 试剂3.3.1 无血清培养液3.3.2 IL-2 （100 万 IU/瓶）3.3.3 IL-15334 0.4%苔盼蓝溶液335 生理盐水3.3.6 人淋巴细胞分离液3.4原材料3.4.1外周血，脐血，骨髓等4操作步骤分血：4.1

3、培养瓶的处理： 吸取NK细胞激活剂500ul，用生理盐水稀释至 6ml，加到75cm 2的培 养瓶中混匀后，放置于37° C。1h后取出备用。4.2将不同来源的血样，用生理盐水稀释一倍；4.3 Ficoll密度梯度离心，2000rpm，25分钟；4.4吸取血浆，置 56° C,灭活20min ;灭活血浆，3000rpm， 15min ；4.5白膜层用移液管吸入到新的50ml离心管中，用生理盐水洗涤细胞两次，第一次为2100rpm， 6min ;第二次为 1500rpm， 6min ；4.6从培养箱中取出处理的培养瓶，吸除激活剂，加入生理盐水10ml，轻轻晃动培养瓶，吸除生理

4、盐水；4.7用10-15mlNK培养液重悬细胞悬液，同时补加10%血浆，1000U/ml的IL-2,50ng/ml IL-15 ；将细胞置于CO2培养箱中培养。补液：4.8细胞培养第2天，显微镜下观察细胞生长状态无异常情况，细胞生长良好，培养液变黄，补加 NK培养基至 40ml，同时补加 10%血浆，1000U/ml的IL-2,50ng/ml IL-15。若生 长一般或较差，考虑减量扩增或推迟扩增。4.9细胞培养第4天，显微镜下观察细胞生长状态无异常情况，细胞生长良好，培养液变黄，补加 NK培养基至 200ml，同时补加 10%血浆，1000U/ml的IL-2,50ng/ml IL-15。若

5、生长一般或较差，考虑减量扩增或推迟扩增。4.10培养第7天，镜下可观察到较大集落，将细胞体积从200ml扩大至600mL，转移至1.8L培养袋，并补加 1000U/ml的IL-2,及1%的血浆。4.11培养第9天，镜下可观察到较大集落，将细胞体积从600ml扩大至1200mL，并补加1000U/ml的IL-2,及1-2%的血浆。分袋：4.12培养第11天，将总体积扩大至2L（ 2袋）。再加入1000U/ml的IL-2及1-2%的血浆。检菌：4.13细胞培养第13天，对细胞悬液进行检菌、内毒素检测。用5mL注射器分别从培养瓶和袋内抽取少量细胞悬液，加入正置的平皿中，放入35C恒温生化培养箱，记录放入日期及培养物品。隔夜后倒置，保留48小时。收获：4.14正常情况下，第 14、15天收货细胞悬液，进行回输。若因临床需要