乳腺干细胞分离鉴定及催乳素对其分化影响的初步研究(0页)

1、试验总思路图试验一乳腺细胞的扩增培养试验流程图实验试剂：双抗(青霉素，硫酸链霉素)，上皮生长因子(egf),二甲基亚矶 (dmso),胎牛血清(fbs),基础培养基dmem/f12,氢化可的松(he),转铁蛋 白胰岛素(its),胰蛋白酶培养液：dmem/f12 + fbs (10%) +egf (20ng/ml) +bfgf (20ng/ml) +iie (5ug/ml) +tts (1%) + 双抗(loounit/ml)冻存液：dmem/f12(70%) +fbs(20%) +dms0(10%)实验方法：解冻原代细胞至卡式培养瓶屮，加入35iiil培养液，放入37°c、5. 0

2、%c02培 养箱中，视培养液情况更换培养液，培养至7080%汇合时传至二三个卡式瓶, 继续培养，当细胞张至7080汇合时使用0. 05%朕蛋白酶一0. 025%edta溶液消化 78min,待有细胞脱离培养皿底吋加入含有10%胎牛血清的基础培养基终止消化。1600rpni/niin离心5min,弃上清液，一部分细胞加入适量冻存液吹打均匀, 放入冻存盒中，置于-80°c冰箱中冷冻24h后取出，快速放入液氮中留种备用。 另外一部分使用试验二中无血清培养基吹打均匀后进行实验二。实验二 乳腺干细胞的筛选ut试验流程图:试验试剂：dmem/f12, b27, egf, bfeg,肝素，膜岛素，

3、0. 25%胰蛋白酶一0. 01%edta 溶液培养液：dmem/f12+b27(2%)+egf( 10ng/ml )+bfgf( 10ng/ml )+he( loug/ml) + 胰岛素(5ug/ml) + 双抗(loounit/ml) + 肝素(4ug/ml)试验方法：利用0. 05%朕蛋口酶一0. 025%edta将实验一中得到的细胞消化成细胞悬液， 吹打均匀后使用使用200目细胞筛过滤得到单细胞悬液。将得到的单细胞悬液使 用台盘蓝染色计数，将细胞悬液屮细胞密度调整为大于20000个/ml,将细胞悬 液加入超低粘附性培养血中，于37°c、5. 0%c02培养箱中培养。培养过程中

4、应密 切注意观察，除去贴壁细胞及死细胞。100g/min离心更换培养液。死细胞可通 过加入dna酶的方式除去。培养一段吋间后出现细胞团，使用吸胚管将单个细胞团吸至96孔板中，使 用0. 05%胰蛋白酶一0. 025%edta溶液消化lomin得到单-细胞悬液，此吋的单细胞 悬液即可视为初步筛选得到的乳腺t细胞。乳腺干细胞通过实验一所用方法大量 扩增后冻存和用于进一步实验。实验三 乳腺干细胞的诱导分化试验流程图:iv型鼠尾胶原处肌卜皮细筛选后的乳腺干细胞理过的培养皿f 胞诱导液试验a:培养一段时间后观察是否出现梭形、体积小，有名个细长突起状细胞一 |上下颠倒数次5。吶n,心离"聞弃上清

5、一瓷j燥加入无酶水 测定0d值 反转录为cdna pcr扩增（ul） mix： 12.5 引物：模板: lddh2o： 9.51%琼脂糖凝胶电泳检测试验b：试验试剂：dmem/f12, fbs, egf, bfgf,胰岛素,氢化可的松,its,催乳素,双抗，iv型鼠尾胶原乳腺干细胞诱导为乳腺腺上皮细胞培养液：i)mem/f12 + fbs( 10%) +egf(20ng/ml) +胰岛素(5ug/ml) + 氢化可的松(5ug/ml) +its (5ug/ml) + 催乳素(5ug/ml) +双抗(100iu/ml)乳腺干细胞诱导为乳腺肌上皮细胞培养液：dmem/f12+fbs(10%) +

6、13毓 基 乙 醇(0. lmmol/l) +bfgf (20ng/ml) + 双抗(100 unit /ml)试验方法：试验a：乳腺干细胞诱导分化为肌上皮细胞将实验二分离得到的乳腺干细 胞接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上(60 mm培养皿屮加入50 pig/ml的iv型胶原 0.5 ml,其它规格的培养血按此比例添加，4°c过夜)，加入诱导分化培养液，放 入37°c、5. 0% c0?培养箱屮培养。随着试验进行观察细胞形态，拍照记录。细胞出现预期细胞形态而及出现后，加入适量体积的细胞裂解液(trizol), 震荡，使细胞充分裂解，室温静置处理5mino再加入约0.2ml氯仿溶

7、液，剧烈 震荡15s,室温静置处理5min, 10000g/min, 4°c离心15mino此时溶液分为3 层，吸取上清约0. 5ml,移至新的1.5汕离心管中。加入等体积异丁醇，室温静 置20min, 10000g/min, 4°c离心10min,弃上清。随后加入75%乙醇lml,混匀, 5000r/min, 4°c离心10min,弃上清，用75%乙醇再洗一次。室温干燥23min, 加入适量适量无酶水溶解，并测定0d值。随后，按super script tt cdna合成 试剂盒说明书进行下一步操作，合成cdna, rt-pcr反应条件：37°c, 1

8、5 min； 85°c, 5 s； 4°co进行特异基因片段扩增，退火温度需引物合成后t己摸索。1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有r的基因片段。试验b：以筛选得到的乳腺干细胞为材料，接种到经过iv型鼠尾胶原处理过的 培养板中，鼠尾胶原的量与试验a按同比例添加。毎孔接入2x10”个细胞，先加 入普通干细胞培养液，24小时后换成含冇5ug/ml催乳素的培养液。继续培养， 搜集细胞，提取总rna,反转录为cdna,进行特异基因片段pcr扩增，包括分化 基因ckl9及未分化基因cd24、cd49f、cd29。引物序列基因名称引物序列5' ->3'备注ckl9gcag

9、atgacttccgcaccaaaagcgagcctccgtttcc参考文献5和参考文献6a -actintacggctgcttcttcctcgcctgcctcatcatactcttcd24tgggctgtggaacagattcaagcatcagtgtgtgaccatgt根据ncbi检索得到的基因(xm_003585775. 2)后使用 primer3. 0 设计cd29acttggtggcatcgttttaccgctgacttaggga参考文献5和参考文献6cd49fgtggctgctttacctgtccttccttgctttccgatg参考文献5和参考文献6试验四乳腺干细胞特异性基因的检测

10、hi试验方法：以实验二筛选出的乳腺干细胞为材料，提取总rna进行反转录为 cdna,以干细胞特异性基因cd49f、cd29、cd24为目标进行pcr扩增，1%琼脂糖 凝胶电泳检测是否有特异性基因片段产生。试验五western blot分析小引试验流程图：制作变性聚丙 烯酰胺凝胶蛋白质电泳转移至pvdf膜浸入封闭液封闭室温下振荡l2h。加入一抗，4°c过夜tbst漂洗pvdf膜3 次，每次lomin二抗室温孵育lhtbst漂洗pvdf膜3 显色次，每次lomin拍照记录结果试验方法：收集悬浮培养的乳腺干细胞，使用全蛋白捉取试剂盒捉取乳腺干细胞 蛋白，进行western blotting

11、检测乳腺t细胞cd49f抗体的和cd29的表达。试 验步骤如下：（1）制作变性聚丙烯酰胺凝胶按照使用说明书装配好灌胶用的模具。将a液（丙烯酰胺储备液）、b液（4x分 离胶缓冲液）及蒸憾水混合，加入过硫酸镀和temed,轻轻搅拌使其混匀，将凝 胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内。加入适量的分离胶溶液吋，在分离胶溶液 上覆盖一层水层。吸尽覆盖在分离胶上的水将a液、c液和蒸饰水在三角烧瓶或 小试管中混合，加入过硫酸钱和temed,并轻轻搅拌使其混匀。将浓缩胶溶液用 吸管加至分离胶的上而，盲至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。将梳子插入凝胶内， 直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。凝胶聚合后，小心拔出梳子。

12、将凝胶 放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入内外电泳槽屮，使凝胶的上下端均能浸泡在缓 冲液中。（2）取20 ul细胞蛋口并加入5ul 5x±样缓冲液混合均匀，90100°c煮沸 5mino使用微量注射器向加样孔中加入上述混合液，将电压调至70v,当混酚蓝 进入分离胶后再将电压调至100v,待溟酚蓝染料跑到胶底处停止电泳。（3）釆用半干转移,电压20v,吋间是50mino（4）取出pvdf膜，将膜浸入封闭液中封闭，室温下放入摇床振荡广2h。（5）一抗（兔抗人的cd49f抗体、小鼠抗人的cd29抗体）4°c孵育过夜。（6）用 tbst 漂洗 pvdf 膜 3x lomin。

13、（7）二抗（hrp标记的igg）室温孵育lho（8）用 tbst 漂洗 pvdf 膜 3x lomin。（9）采用发光底物显色。（10）拍照记录试验结果试验六催乳素对乳腺干细胞最适作用浓度的确定试验流程图接种到24孔板小，每孔_约为20000个，培养24h37c孵育4h弃除 孑l内上清液酶联免疫检测仪上 测定各孔的吸光度随机将细胞分成5组，分别 加入含有0、5、50、500、1000 ug/ml催乳素的培养加入二甲基亚飒振荡 30 min试验七 催乳素受体mrna的检测 试验流程图试验八 不同催乳素浓度作用下乳腺干细胞分化后基因ckl9、b 酪蛋白表达mrna 的检测试验流程图反转录为cdna

14、, 进行pcr扩增ljcapuco av, ellis s, wood dl, akers rm, garrett w. postnatal mammary ductal growth: three-dimensional imaging and expression of steroid receptors in prepubertal calves. tissue cell2002;34:9-202 a. v. capuco, r. k choudhary, k. m. daniels, r w. li and c m. evock-clover ； bovine mammary stem

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