人体外周血单核细胞的分离与鉴定

1、人休外周血单核细胞的分离与鉴定上海市尢疫学研究所基越丸疫研究宣张一平陆佩华徐丈玉樊绮诗涂苍宁或人杰附图pet811分高细购示意图单核细胞在免疫反应中的作用已日益受 到重视，但目前对人体单核细胞的研究，除 应用斑酸bt发鞄技术外（叫大多数实验室采 用平皿粘附技术从外周血获得单核细胞 我们卷照gmelig-meyling报道的用percoll 分淘人体外周血单核细胞的方法，根据本 实验室条件加以修改，并对分离所得各组分 细胞进行t、b、单核细胞百分比的鉴定， 及其对杭物血凝素（pha）的反应性的测定.材料与方法一、单核细胞的分离 采用pcrcoll连 续僭度梯度分离法。方法如下:先用淋巴细 胞分离

2、液（f/h液，比重1077,上海试剂二 厂出品）分离出外周血单个核的细胞，该细 胞组分以f表示。除留一定数量细胞作对照 鉴定外，其余细胞以无血淸rpmi 1640液1 奄升悬浮之，浓度为2035 x 细胞/亲升.取 105percoll 原液（瑞典pharmacia 岀品，209条件下测得其比垂为1.030）, 加双离子强度确酸缓冲蔽（0.30m nacl, 0.02dm确酸缓冲液.ph74）9毫升。充分混 匀后，平均分至两只半透明软須料管（宜径 1.2 h米，高9厘米）中，置高速离心机（英 国mse出品，角式转头，45p偏角，4© 14.00015,000转/分离心40分钟，以形成

3、 连续密度梯度。将上述高浓度f组分1砥升轻轻铺于 pcrcoll液面上.于水平式离心机（北京医疗 仪器厂出品，lxj ）2,000转/分离心20分钟。经如此处理后, 一般可分得4个细 胞组分（附图）。用 吸管吸取组分a, 得到富含单核细胞 的群休（m）'吸取 组分皿，得到缺乏 单核细胞的小淋巴 细胞群体（p）。将所 得m与p组分细 胞分别用hanks液洗涤两次后计数，并进 行各种形态与功能鉴定。二. 活力鉴定 以常规锥蓝排斥试验鉴 定细胞活力，结果以存活细胞百分比农示三、形态鉴定（一）瑞氏染色 常规制 片后行瑞氏染色，于油犍下读片，计数单核 细胞百分比。（二）乳胶吞噬试验 除所用乳胶颗

4、粒直 径约为004微米外（上海市医学化验所岀 品），其余大致与pichler等使用的方法 相同。结果以吞噬阳性细胞百分比表示。（三）非待异性酯酶染色采用活性花 环酯酶双标记技术，结采以酯酶柴色阳 性细胞百分比表示。（四）细胞膜表面免疫球蛋白荧光抗体标 记 方法详见文献，结果以膜表面荧光阳 性细胞百分比表示。四. 功能鉴定用体外pha刺激试 验，结果以每组三个复管的平均每分钟脉 冲&（cpm） ±标准差（sd）来表示。进俺人员结 果一、单核细胞的活力与得率经f/h 液和percoll液两次分离后，共得三个细胞 组分，即组分f. p、mo各组分细胞活力 均大于95第。m组分细胞得

5、率为10.5兔， p组分为62.1（ 1）,合计细胞回收率为 726%。二、各细胞组分中t、b细胞比例的改 变 以非特异性酯酶染色阳性细胞作为t细 胞，以细胞表面免疫球蛋白荧光标记阳性细 胞作为b细胞，然后观察t、b细胞在f, p表1 percoll分离前后各细胞组分的需力与得率细胞组分例数 «eft（xio»）得半"）f，1127.3±6.7p11 1& 8±6.862.1>95m112.9±1.910.5*即供进一步分离“与p绸分细灼w用的绷胞妆（用 均值±sd表示，下英同和m三个细胞组分中百分比的变化。p

6、crcoll 分离ffi!（f组分），t细胞占81.8外，分离话 p组分t细胞占86.3輪，m组分占355%。f组分b细胞占13.5,分离后p组分b细 胞占8.2%, m组分占16.6%（友2）。表2 各细胞组分t、b和皿核细胞中阳性细胞百分率严纶屜组分酯陆染色 （t细胸）染也（b细胞）瑞氏染色 （的核细跑（吊桂细他）f81.8±3.813.5±4.716.2±5.716 4±4.1p86.3±5.18.2±5.05.8±4.237±1.bm35.5±19.116.6±11.078.4±

7、;4264.9±11.2经：则验.m组分单披细胞百分率阴昱岛于f与p组分（p<o.ool）；f组分b细胞百分率琲于p组分（尸<0.05）三、各组分中单核细胞比例 以瑞氏染 色分类计数和乳胶吞噬试验（吞噬阳性细胞 作哝核细胞）鉴定各细胞组分中单核细胞百 分比（表2）。m组分中用瑞氏染色法鉴定的 单核细胞百分比为78.4%,乳胶吞噬鉴定 时为649%。四、乳胶呑噬试验与瑞氏染色的比较表3 两种单核细胞鉴定方法的比较组分瑶氏染色单核细狗（）乱较外协p ifi甲假细胞（）f716.2+5.7916.4±4,1>0.05p858±4.2103.7±

8、;l8>0.05m8784±19.8864.9±1l2 >0.05f，143.3±2.4713.7+3.8<0.001*为2793匸放篮3小时仍进行霸定两种方法所鉴定的各组分单核细胞百分比的结果比较，及较高室温（2733°c）条件下样 品放置3小时对该两项鉴定的形响见表3。 结果显示，两种鉴定方法之间无显著差并 （p值均0.0b）。f组分细胞在室温条件下 放置3小时后再进行两项测定，瑞氏染色法 所检出的单核细胞百分比明显降低（16.2: 33轴，p<0.001），而乳胶吞噬试验不受 其影响（p005）。五. 各组分细胞対pha刺激

9、的反应 以 细胞对pha刺激的反应性作为细胞功能判 斷指标，所测得结果如表4所示。分析刺激表4 各级分对pha刺激妁反hy.fft 0*（单位：cpm）俎分实验l3妙1f483±107110±75i±upm±3i96 ±3444±llf+pilaid 1289 ±3572692154 ±63791073+6j3(292)(846)(20)p+pha90850±?t303 161132±12788 2718±2252(818)(1078)(61)m + phaa79±2083&

10、#177;1676±21（）内散值即si,为f+pha的cpm kjfft号f的cpxn均（ft.>11,余类推 m细岚为0.05x 10，（vr炖细曲 持数的变化，p组分细胞对pha反应的刺 激描数（s1）值约为f组分细胞的2倍,三次实 验结果分别 318:292、1678:846 和 6x20。 m组分细胞对fha的反应极低.大致与 对照相当。讨 论percoll是一种经聚乙烯毗酪烷s（pvp） 处理过的硅胶颗粒.对细胞无莓性切。由于 percoll分离可除去死细胞（附图），故其细 胞活力可优于f组分。f组分细胞活力一般 均大于95% （表1）,而percoll进一步分离

11、的p与m组分细胞的活力可达98以上。一般来说，用f/h液可从外周血回收 80%单个核的细胞，洗涤时继续丢失10 怖门°】。我们认为，每毫升健康人外周血可 回收1x106个单个核的细胞。该组分（f）主 要成份为t细胞、b细胞和单核细胞，还含 冇极少量的粒细胞与红细胞。f组分婭percoll 进一步分离后，m组分得睾为10.5%, p组 分为62.1%（表1）。总共可冋收72.6伽，也 就是说丢失了种入细胞的30%弱。极少挺 粒细胞与红细胞亦可除净。改进工作条件如 降低工作环境温度、用涂有硅油的试管进行 操作和冷hanks液洗涤等，细胞回收率尤其 是单核细胞回收率可望进一步提高。在分离淋

12、巴细胞的过程中，应注意t.b细胞比例是否有改变。表2显示，组分p 的t细胞百分比（86.3% ）略髙于f组分 （81.8%）,但两者之间无明显羞异;在观察f 和p组分细胞对pha刺激的反应（表4）时 发现，p组分的s1值明显奇于f组分约为 其2倍。由于pha剌激的反应是以t细胞 为主的反应，故提示p组分中t细胞比率比 f组分中的高。同理，m组分中t细胞的比 率很低（表2,4）。分离前（f组分）b细胞均值为135的， 分离后p组分中b细胞均值为8.2殛，减少 5.3%,两者之间差异显著（p<005）°这与 gmelig-meyling 的报告不一致。我们 认为p组分中b细胞减少的

13、可能性是存在 的。因为理论上b细胞形态比t细胞略要大 一些，密度也小一些，而percoll分离单核细 胞是根据stokes原理进行的，故b细胞较 易被分到m组分中去。m组分中b细胞 （166怖）确实要比f俎分中的（】35%）高， 但两者之间无显善左界。另外已有人应用 stokes原理，以percoll分离t、b细胞获得 成功1,no用percojl分离单核细胆足切实可行的。 无论是从瑞氏染色、乳胶吞噬（表3）,还是 从非转异性酯酶染色的结果（袤2）分析.m 组分中单核细胞百分比与f及f组分中的均 有非常显著差界，其p值均小于o.ooi0 a 得注怠的是，m组分中单核细胞的纯度，用. 瑞氏染色鉴

14、定为仙帀.乳胶吞噬略低，为 649貉，两者间无明显差异（p005）.其均 值为75%。m组分中单核细胞纯度较髙这一 爭实还可从m组分细胞（0.05 x诃）对pha 基本无反应得到证明（表4）,提示m组份中 混入的t细胞极少，约10%。soman等认为f/h液分离的单个核的 细胞群体中（本实验为f组分），单核细胞 占1322節门叫 本文鉴定的f组分中推核 细胞占16%左右，与其一致。瑞氏染色与乳 胶吞噬这两种方法并无差异（表3）。但进一 步分析，较高室温（27°33°c）条件下，f组 分放置3小时后对该两项测定的影响发现， 前者鉴定的单核细胞百分比明显下降（pc 0.001）

15、,提示放置过程中大fit肛核细胞贴壁， 影响了鉴定结果。有趣的是乳胶吞噬试验不 受其影响（p005）.提示单核细胞贴壁后 也能吞嫌乳胶颗粒，并在吞噬颗粒后丧失或 削弱了其貼壁能力，故不影响鉴定结果。就 此而言，乳胶吞噬法优于瑞氏染色法。观察f组分与p组分对pha剌激的反 应能力（表4）,表现出p组分的反应能力不収正常，而且增加轴度较大，英s【值与f组 分的相比，一般为其两倍。从反应细胞角度出 发，这种现象可解释为p组分中t细胞比率较 高所致。但本文中两者间t细胞所占的百分 比并无羞异，与此無释矛盾。另一方面，人体 外周血淋巴细胞对pha的反应是一种依赖 单核细胞的现象厲心.我们也观察到尼龙 棉

16、分离的t细胞对pha无反应，加入一定 m m组分细胞后对pha的反应恢复正 常 w 而本文中，p组分单核细胞百分率明 显少于f组分（p<0.001）t故p组分对pha 反应的剌激指数值较f组分髙的现象也可解 释为：辅助t细胞对pha的反应仅有少童 单核细胞就能完成，当单核细胞比率更离时 （f组分），反而可表现出一定的抑制效应这 与那种少虽巨噬细胞时就足以完成抗原提呈 功能.诱导免疫反应.而大fielffi细胞存在 时，却渋现出一定的免疫抑制效应的观点一 致。但这并不是唯一的解释，圮近lee在动 物实验中发现，唯形态最小，昱不成熟的巨 噬细胞才具有抗原提呈功能幕不难理解， percoll分

17、离的p组分中存在的单核细胞，形 态较少的居多。故分析p组分对pha反应 较高的原因时，还需考虑单核细胞亚群改变 的彫响。其机理有待研究。总之，用prcoh分离较纯的单核细胞 是可行的，方法也较简便，有利于应用该项技 术对单核细胞在免疫反应中的作用进行多方 面的研究与探索。參考文itt1. 张友会笄：中华氏学杂恋，10:803. 197&2. territo mc et al: j immuno】. 118:187. 1977.3 gmclig-meyling f et al: j immunol methods, 33:1, 1980.4-上海免疫学研宪所：免疫学卖強抿寻（内部快料几1

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