应用PCR-DGGE和454焦磷酸测序分析儿童龋病相关口腔菌群多样性

1、.致谢本 论 文 的研 究 工 作 是 在 导 师 项 春 生 教 授 的 悉 心 指 导 和 关 怀 下 完 成 的 。 三 年 以 来 ，从 论 文 的选 题 、研 究 计 划 的设 计 、实 验 材 料 的构 建 、具 体 方 法 的选 择 、研 究 结果 的分 析 到 论 文 的修 改定 稿 ，项 老 师倾 注 了大 量 的心 思 ，给 子 了我 很 大 的 帮 助 。 在 学 习和 实 验 过 程 中 ， 您 扎 实 的知 识基 础 ，深 厚 的 学 术 底 蕴 ，严 谨 的 治 学 态度 ， 孜 孜 不 倦 的 学 习和 工 作 精 神 都 使 学 生 获 益 匪浅 ; 生 活 中

2、 ，您 待 人 和 蔼 可 亲 ，谈 吐 幽 默 风 趣 与 学 生相 处 融 洽 ，在 很 多 事 情 上 都 体 现 了您 对 学 生 的悉 心 培 养 和 关 怀 。 藉 此论 文 完 成 之 际 ，再 次 向项 老 师 致 以最 诚 挚 的 感 谢 和 最 衷 心 的祝 福 !同 时 要 感 谢 实 验 室 的 师兄 师姐 的 帮 忙 ，特 别 要 感 谢 凌 宗 欣 、 张 琼 、刘 芳 、 牟 晓 洲 、 袁 立 、赵 娜 、 陈伟 光 、 陈 晓 怡 、李 益 飞 的 帮 助 和 支 持 。2 00 9 年 12 月 18 日于 杭 州 华 家 池.;浙 江 大 学 硕 士 学

3、位 论 文目 录目录目录 . . . . . 。. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 工缩 写 词(Abb r evi a t io n) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 工H摘 要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IVA b s t r a c t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V引 言 :. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1第 一 章 文 献 综 述 . . . . 31.1 口腔 微 生 物 的 研 究 . 31.1.1 微 生 物 研 究 的 进 程 .，. 31.1.2 龋 病 的 介 绍 .41.1.3 口腔 龋 病 的 研 究 . 41.1.4 龋 病 的 发 病 机 理 .，. 51.1.5 形 成 龋 病 的 内 外 在 因 素 .，.，. 51.1.6 龋 病 的 诊 断 及

5、预 防 . 61.2 分 子 生物 学 方 法 在 微 生物 领 域 的应 用 .，.，.71.2 .1 16 5 核 糖 体 D N A (165 rD N A ). 71 .2 .2 P C R 一D G G E . ，. 81.2 .3 4 5 4 焦 磷 酸 测 序 技 术 .，. 10第 二 章 样 本 采 集 及 PCR 扩 增 细 菌 16 5 rDNA 基 因 . 132 ，1 材 料 和 方 法 .，. 132 .1.1 取 样 . .，. 132 .1.2 核 酸 的 抽 提 .，. 132 .1.3 核 酸 的 测 定 .····&

6、#183;······················· 142 .1.4 P C R 扩 增 .，. 1 42.2 结 果 与 分 析 .，.，.，. 巧2.2 .1 样 品 收 集 情 况 统 计 .，.，. 巧2.2 .2 P c R 扩 增 结 果 .，.·········

7、;············，···· 巧 第 三 章 DG G E 图谱 分 析 口腔 菌 群 多 样 性 . . . . . . . . . . . . . . 17 3 .1 材 料 和 方 法 二，.，.，. 173 .1.1 引 物 的 设 计 和 P C R 反 应 条 件 . 173 .1.2 琼 脂 糖 电泳 .·········&#

8、183;·················· ·· 173 ，1.3 割 胶 回 收 .，.···· 183 .1.4 D G G E 电 泳 .，. 183 .1.5 D G G E 条 带 鉴 定 . .············

9、3;······，········ 193 .1.6 D G G E 图 谱 分 析 .，.·.·.···············一2 03 .2 结 果 和 分 析 .，. 2 03 .2 .1 含 有 G C 夹 子 的 P C R 扩 增 结 果 .，. 2 0浙 江 大 学 硕 士

10、 学 位 论 文目 录3 .2.2 D G G E 图 谱 分 析 .，.，. 21第 四章 45 4 焦 磷 酸 测 序 对 口腔 菌 群 多 样 性 分 析 . . . . . . . . . 244 .1 材 料 和 方 法 .，244 .1.1 测 序 样 品 的 准 备 .，. 244 .1.2 4 54 测 序 结 果 预 处 理 . 2 44 .1.3 序 列 的 比对 和 聚 类 . 254 .1.4 统 计 学 分 析 O T U s 的 丰 度 : rare fac tio n 曲线 ，C h ao l 和 A C E . 254 .2 结 果 与 分 析 .2 64.2

11、.1 b acord e 的 设 计 .，. 2 64.2 .2 4 54 测 序 得 到 的 数 据 的 特 征 .274.2.3 C A C 和 C F C 口腔 菌 群 的 丰 度 和 分 类 .284.2.4 根 据 焦 磷 酸 测 序 结 果 分 析 口腔 菌 群 组 成 和 分 布 .，. 32第 五 章 讨 论 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37第 六 章 结 论 和 展 望 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42参 考 文 献 . . . . 43附件 (

12、 一 )收 样 情 况 及 核 酸 提 取 记 录表 . . . . . . . . . . . . . 48个 人 简 历 . ，二 ， ，.，. . 51浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文缩 略 词 (A b b rev iatio n )缩 写 词(A b b rev ia tio n )A C I a c r y la m id e丙 烯 酞 胺A m pa m P ie illin氨 节 青 霉 素B ISb is一a d r yla m idN 一甲叉 双 丙 烯 酞 胺B L A S Tb a s ie lo e a l a lig n m e n t s e a rc h

13、to o l基 因局 部 连 配 搜 索 工 具b Pb a se P a ir碱 基 对C D N Ae o m P le m e n ta r y d e o x y rib o n u e le ie a e id互 补 脱 氧 核 糖 核 酸D N Ad e o x y r ib o n u e le ie a e id脱 氧 核 糖 核 酸d N T Pd e o x y rib o n u e le o sid e t riP o sP h a te脱 氧 核 糖 核 普 三磷 酸E D T Ae th y le n e d ia m in e te tra a c e tie a

14、 c id乙二 胺 四 乙酸hKLmD rlh o l lr小 时七lB·，llC万，恤卫mK ilo b a se千 碱 基 对lu r ia 一B e r ta n i m e d iu mL B 培 养 基m in u te分 钟P o ly m e ra se e h a in re a c tio n聚 合 酶 链 式反 应r ota tio n P e r m in u te每 分 钟 转 速re v e r s e t ra n s e riP ta se P C R反 转 录 聚 合 酶 链 式 反 应s e e o n d秒A rn rn o n iu m P e

15、rsu lf ate S o lu tio n过 硫 酸 按 溶 液T E b u f fe rT E 缓 冲 液T E M E DN ，N ，N ，N ，一te tra m e th y le t hy le n e d ia m in eN ，N ，N，N一四 甲基 乙二 胺T I iST ri s(h y d ro x y m et hy l)am in o m eth a n e三 ( 经 甲基 ) 氨 基 甲烷n u e le o tid e核 普 酸R ib o so m al D atab ase P rojeet核 糖 体 数 据 库 项 目C A CC a r le s a

16、e tiv e o f e h ild re n患 有 龋 病 儿 童C A FC a rle s f re e o f e 址 ld re n无 龋 病 儿 童尸浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘 要摘 要口腔 微 生 物 在 维 持 口腔 内环 境 稳 定 上 起 非 常重 要 的作 用 。龋 病 是 非 常 常 见 的 一 种 牙 齿 疾 病 ，特 别 是 在 幼 儿 期 。然 而对 于 患 有 龋 病 的儿 童 口腔 内微 生 物 整 个 菌群 结 构 和 动力 学研 究 至今 仍 未 被 清 晰 的 阐 明 。 在 本 实 验 中 ，利 用 P C R 一D G G E 与4

17、 54 高 通 量 焦 磷 酸 测 序 技 术 相 结 合 ，对 患 有 龋 病 儿 童 ( C A C ，下 同 ) 和 无 龋 病 儿 童 ( C F C ，下 同 ) 口腔 内的微 生 物 菌群 进 行 多样 性 的 比较 分 析 。收集 这 些儿 童 的 唾 液 和 牙 菌 斑 ，提 取 D N A 。设 计 通 用 引物 测 序 扩增 165 rD N A 基 因 V 3 变异 区进 行 测 序 和 D G G E 分 析 。测 序 总 计 得 到 1867 87 条 序 列 和 4 19 05 个 单 一序 列 ，经 鉴 定 细 菌 来 源 10 个 门 的 200 多 个 属 。

18、研 究 结 果 显 示 来 自 C F C 和 C A C 的 细 菌 可 以聚 成 两 个 簇 和 若 干 个 种 型 ，在 娘 上 菌 斑 中 及八，tococcu: ( 连 锁 状 球 菌 属 ) ，玲illonezla ( 韦荣 球 菌属 ) ，A ctino恻 ces 丈放 线 菌 属 )，份 an uzsca tella ( 颗 粒 链 菌 属 )，去印 totric人ia ( 纤 毛 菌 属 )和 几 iom o nas ( 硫 单 胞 菌 属 ) 与 龋 病 有 关 ，这 些 细 菌 相 互 作 用 ，逐 渐 破 坏 生 态 平 衡 ，最 终 导 致龋 病 的发 生 。我们 无

19、 法 找 到 一 个 单 一 的 致病 菌 但 是 发 现 了对 龋 病 发 生 有 着 显著 相 关 的 致 病 菌群 ，而 且这 些 致 病 菌群 有 可 能成 为 干 预 龋 病 发 生 的 目标 。关键 词 : 微 生物群 ， 多 聚 合 酶 链 式 反 应 一变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 ，牙 菌 斑 ， 焦 磷 酸 测序 ， 唾 液户浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文A b s t r a e tA b s t r a e tO ra l m ic ro b io t a P la y s a v ita l ro le in m a in ta in in g th e h

20、 o m e o sta s is o f o ra l e a v ity . D e n ta l c 硕 e s a re a m o n g th e m o st e o m m o n d ise a s e s in c h ild re n . P a th o g e n ie b a e te r ia c o n t r ib u t e to th e d e v e lo P m e n i o f th e d ise a s e . H o w e v e r ，th e o v e ra ll str u e t Ur e a n dd y n a m ic s

21、 o f b a c te r ia l e o 们n nnu n itie s in o ra l e a v it y f ro m e h ild re n w ith d e n ta l e a rie sh a v e n o t b e e n e x P lo re d d e e P ly h e re to f o re . In th is st u d y ，w e e x a xn in e d th e b a e te ria ld iv e rsity o f o ra l m iero b io ta fro m e hild ren w ith e ari

22、e s in e o m P a riso n to th o se fro mc而 es一free ehild ren u sin g P C R 一D G G E an d h igh 一thl ou gh P u t b areo d ed P y rosequ en ein g .S a liv a a n d su P ra g i n g iv a l P la q u e sa m P le s w e re e o lle e te d f ro m6 0 c h ild re n . D N A w a s iso la te d f ro m t he se sa m P

23、le s a n d th e h y P e r -v a ria b le V 3 re g io n o f 1 6 5 rD N A g e n e s w a sa m P lif ie d u sin g u n iv e rsa l P r im e r s. A to t al o f 1 8 6 7 8 7 se q u e n e e s w e r e o b ta in e d a n d 4 19 0 5 u n iq u e se q u e n e e s re P re s e n t e d a ll d o m a in s in o u r st u d

24、y . M o re t h a n 2 0 0 g e n e rab e lo n g in g to 1 0 P h y la w e re id e n tif ie d .O u r d a ta sh o w e d th a t t h e o ra l m ie ro b io ta in s a liv a a n d su P ra g in g iv a l P la q u e s e o u ldb e d iv id e d in to t w o c lu ste rs a n d se v era l p h y lo t yp e s t ha t w e r

25、e sig n if ie a n tly d if fe re n tb e t w e e n th e tw o P a tie n i g ro u P s . T h e g e n e ra o f S lr e P to c o c c u s ， V e illo n e lla ，A c rin o 恻 c e s ，G r a n u lic a te lla ，L e P to t ric h ia a n d 几 io m o n a s in su P ra g in g iv a l P la q u e sw e re a s so e ia te d w ith

26、 d e n ia l e a rie s . T h e se g e n e ra in te r ae te d w ith e a c h o th e r in tim a te ly a n d e h a n g e s t h e c o m P o s itio n o f th e b a e te r ia l P o P u la tio n d e stro y e d t h e e u b io s is o f th e m ie ro e o sm g r a d u a lly a n d e o n trib u t e d to t h e d e v

27、e lo P m e n t o f d e n ta l e a ri e s . T h e re w a s n o o n e sP e e if ie P a th o g e n b u t P a th o g e n ie e o r nm u n itie s th a t e o r re la te d w ith d e n t a l e a ri e s s ig n if ie a n tly . A n d th e se s P a th o g e n ie e o m m u n itie s m ig h t P ro v id e a d d itio

28、 n a l ta rg e ts f o r d e n ta l e a ri e s in te r v e n tio n .K e y w o r d s : m ic ro b io ta / P C R 一D G G E / P la q u e / P y ro s e q u e n e in g / s a liv aV产 O浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文引 言引言 :近 几 年 对微 生 物 元基 因组 的研 究发 现 ，与人 体 相 关 的微 生物 的数 量是 人 体 细 胞 总 数 的 10 倍 ，这 让 我 们 开 始 意 识 到 人 体 和 这 庞 大 数

29、 量 的微 生 物 群 结 合 成 为 “超 合 体 ”(Gi n et al. ，20 06 )。一 些微 生 物 是 致 病 的 ，但 是 大 部 分 是 无 害 的 或 者 在 人 体 生理 活 动 中扮 演 必 不 可少 的 角色 ，包 括 发 育 、免 疫 应 答 、消 化 营 养 和 维 生 素 的合 成 11一3。 口腔 中的微 生 物 作 为 人 体 最 为 复 杂 、数 量 最 为庞 大 的微 生物群 ，对 口腔 健 康 起 着 重 要 的作 用 。在 过 去 的 40 多 年 里 ， 已经 有 25 0 种 口腔 细 菌 被 分 离 ， 并 培 养 鉴 定 ，通 过 独 立

30、 于 培 养 的分 子 生 物 学 方 法鉴 定 出 4 50 种 细 菌 ，这 是 得 到 大 家 的公 认 4。 在 人 体 内 ， 口腔 微 生 物 与 人 体 互 作 作 用 会 影 响 口腔 健 康 5和 一 些 系 统性 疾 病 ， 比如 细 菌 性 心 内膜 炎 6、肺 炎 7、早产 儿 低 出生体 重 8和 冠 状 动 脉 心 脏 病 9。这 些 文 章 的数 据揭 示 ， 口腔 菌群 的变 化 能诱 导这 些疾 病 症 状 的产 生 。龋 病 是 儿 童 口腔 疾 病 中发 生 率 最 高 的 一 类疾 病 l0l。龋 病 是 由于产 酸 细 菌 和碳 水 化 合 物 的发

31、酵相 互 作用 产 生数倍 以上 的酸度 腐 蚀 牙 齿表 面 而 导致 的 ，此外 宿 主 牙 齿 、饮 食 和 卫 生 习惯 等 一 些 因素 也 能促 使 龋 病 的形 成 。龋 病 发 生 的部 位 包 括 牙根 和 牙 冠 ，而且 这 种 疾 病 在 婴 幼儿 就 会 发 生 ，一旦 幼儿 发 生龋 病 ，则 其 乳 牙 就 更 易 受 到 感 染 。龋 病 的发 生有 以下 几 个 因素 : 自身 因 素 、生 物 学 因素 、环 境 因素 、 行 为 因素 和 生 活方 式 ， 具体 而 言 ，是 由高含 量 的 致 龋 细 菌 、不 充 足 的唾 液 流 量 、 氟 化 物 不

32、 足 、 口腔 卫 生 习惯 不 良、不 适 当 的饮 食 习惯 以及 生 活 水 平 低 下 。研 究 发 现 ，牙 菌 斑 是 一 种 具 有 复 杂 结 构 和 功 能 ，由细 菌 组 成 的 生 物 膜 ，是 龋 病 形 成 所 必 须 的 。对 龋 病 发 生 的 解 释 现 有 三 种 推 测 一 一 菌 斑 特 异 性 假 说 、非 菌 斑 特 异 性 假 说 和 菌 斑 生 态 假 说 1一，3。研 究 结 果 显 示 ， 龋 病 很 有 可 能是 致 病 菌 群 导 致 的 ， 而 不 是 单 种 细 菌 引起 的 。 因 此 ，研 究 龋 病 真 正 的 发 病 机 理 显

33、 得 非 常 重 要 。利 用 现 有 的 分 子 生 物 学 技 术 ，最 为 常用 的是 利 用 分 子 指 纹 图谱 技 术 对 进 行微 生 物 种 类鉴 定 和 不 同微 栖 息 地 之 间菌 群 结 构 的分 析 ，例 如 利 用 微 生 物 165 rD N A 基 因 的特 性 进 行 P c R 一D G G E 和 测序 分 析 14。 口腔 中 一 些 普 通 的细 菌 ( 易培 养 和 菌 量 大 ) 已经 通过 克 隆 测 序 的方 法 进 了鉴 定 。但 由于 口腔 细 菌 多 样 性 比较 复 杂 ，且 有 大 量 不 可 培养 的 细 菌 的存 在 ，所 以通

34、常 的 克 隆 测 序 的方 法 既 费 时 ，灵 敏 度 也 不 够 ，一般 只 能浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文 引 言用 于 鉴 定 口腔 优 势 菌 群 。2 0 08 年 ，利 用 新 一 代 测 序 技 术 一 一45 4 焦 磷 酸 测 检 测 了 健 康 成 人 口腔 菌群 的 多样 性 ，其 数 据 结 果 显 示 口腔 菌群 多 样 性 比 已知 的要 复 杂 的 多 l5。 随着 焦磷 酸 测 序 的发 展 ，使 我们 能够 更 全 面 的 了解 微 生 物 菌群 多 样 性 ， 进 行 大 规模 的样 本 分 析 ， 而且 成 本 也 会 越 来 越 低 l6。

35、焦 磷 酸 测序 给 了我们 很 好 的机 会 去研 究 口腔 微 生物 的菌 群 结 构 ，然 而 至今仍 没 有 关 于 口腔 疾 病 状 态 下包 括 龋 病 、牙周 炎 、齿 跟 炎 、牙槽 脓 肿 等 菌群 多样 性 的研 究 。 因此 ，将 来利 用 新 的技 术 对 于 口腔 菌群 的研 究 ，特 别 是 牙 菌 斑 和 唾 液 的研 究 可 能使 我们 能更 清楚 的 了解 龋 病 发 生 的 原 因。本 研 究 收 集 患 有 龋 病 ( C A C ) 和 健 康 儿 童 ( C F C )( 共 计 60 位 ) 的菌 斑 和 唾 液 ，样 本 总 量 为 120 份 ，

36、设 计 16 5 rD N A 基 因 V 3 变异 区 的通 用 引物 进 行 扩 增 ， 产 物 利 用 P C R- D G G E 技 术 进 行 分 析 菌群 多样 性 。然 后 利 用 45 4 焦 磷 酸 测序 系 统 ， 在 引物 中设 计 相 关 生 物 条 形 码 ( B arco de ) 加 以 区别 不 同来 源 的产 物 进 行 测 序 分 析 ，一 次 测 序 上 样 量 为 12 0 个 。结 果 显 示 ，来 源 于 跟 上 菌 斑 中 的 一 些 细 菌 与 龋 病 的发 生 有 关 ，这 些 结 果 使 我们 了解 到龋 病 潜 在 的致 病 菌群 ，对

37、龋 病 的发 生发 展 有 了新 的 认 识 。浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文第 一 章 文 献 综 述第 一 章文 献 综 述1.1 口腔 微 生物 的研 究1.1.1 微 生 物研 究 的进 程在 生 物 圈 里 ，微 生 物 的 数 量 达 到 1护o一1护，是 所 有 动植 物 细 胞 总 和 的 2一3 倍 17。 它们 能够 调 节 大 气 的组 成 、 影 响 温 气候 、 回 收 营 养 和分 解 污 染 物 。 如 果 没 有 微 生 物 ，我们 的 生存 环 境 也 将 不 复存 在 。微 生 物 不 仅 存 在 在 人 体 的 外 在 环 境 ， 也广 泛 分 布

38、 于 人 体 各 个 部 位 : 口腔 ，皮 肤 ，肠 道 等 ，在 肠 道 中微 生物 的数 量 达 到 10 ，3一10 4，是 人 基 因数 量 的 100 倍 。这 些 微 生 物 寄 宿 在 我 们 肠 道 中 ，能够 合 成 人 体 必 须 的 氨基 酸 和 维他 命 以及 促 进 消 化 食 物 中较难 消 化 的 物质 比如植 物 多 糖 ，从 某 种 意 义 上 说 创 门的基 因是 智 人 ( H om o s即 ien s ) “多 源 基 因组 ” 的 一部 分 。 这 些 与人 体 共 存 的微 生 物使 人 体 成 为 了名 副其 实 的 “超 级 生 物 ”( s

39、uP erorgan ism ) 18正 如 其 他 生命 科 学 学科 一样 ，微 生 物 的研 究分 为 两个 阶段 : “简 化 论 ”和 “整 体 论 ”。在 很 长 的 时 间 里 ，研 究者 通 过 分 析 从 个体 分 离得 到 的细 菌 ，不 断 的 细 化 每 个 组份 试 图去 了解 整 个 菌群 多样 性 ( 图 1一l) 。当研 究者 认 识 到 随着 研 究 范 围 的 缩 小 ，认 识 细 菌 多样 性 的难 度 越 来 越 大 ，慢 慢 的 转 变 了观 点一 需 要 整 体 思考 ，形 成 了现 代 对 微 生 物 研 究 的观 点 “系 统 性 ” 和 “整

40、体 论 ”。 从 全 球 微 生 物 基 因 的 调 查 到 元基 因组 再 到 生 物 膜 ( biofilm s )，微 生 物 学 研 究 已经 进 入 到 细 菌 整 体 内各 个 部 分 之 间 的相 互 作 用 的研 究 ，这 也 改 变 了人 们 对 微 生 物 生 理 学 的 认 识 ，提 高 了诊 断 识 别 微 生 物 感 染 的 能 力 9。丹.:d.冲目:曰曰.甘自口几娜.阅肠甲日甘目门口日日日川日=un!I.=勃帅眺蒯扣阵眺而的以以匆图 1一1 微 生 物 研 究 的 发 展 史 。 最 初 的备“简 化 论 ”研 究 主 要 瞄 准 于 从 个 体 复 杂l浏幽 d

41、 如和i翻叔咏 翻 叔咖 讯微 生 物 菌 体 中 分 离 得 到 细 菌 墓 因 进 行分 析 。 随着 “简 化论 ”研 究 的 不 断 深 入 ， 妞川幽d 讥枷l诩 孙劝 的扭l辫研 究 者 慢 慢 有 了整 体 思 考 的 观 点 : 不 同 咨细 菌 之 间 以及 多 种 细 菌 群 体 之 间 的 的!翩 而n时赫 份滋娜 ，翻 卵 目哪倒佣相 互 作 用 。 F IG . l一1 E v o lu tio no flm ie ro b io lo g ie a lst ud ie s .In itia l腼”日。n时疏 馆咐，胎测 ，l雌撼唱牌。眺 叹咖re d u c tio

42、 n ism in e lu d e d z o o m in g in f ro m愉耐腼 时俞 拍川犯习由的。l平，抽，翻d喇甫解 眺，楠 响图 1一1浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 文 献 综 述e o m P le x m u ltisP e e ie s m ie ro b ia l e o m m u n itie s tq iso la te d g e n e s f ro m in d iv id u a l sP e e ie s .T h is P ro eess w as follo w ed by an ex P an sio n o f seo

43、P e b ased o n th e kn o w led g e acq u ired thro u g h re d u e tio n ism to a e h ie v e a h o listie v ie w o f t he in te r ae tio n s o f d if fe re n t b a cte ria l sP e e ie s a n d th e m u ltisP e c ie s e o m m u n itie s in w h ie h th e y r es id e .(K u r am itsu H . K .，H e X .，L u x

44、 R .，A n d er so n M . H .，S h i W . In tersP eeies in teractio n s w ith in o ralm iero bial eom m un ities【J.M ierob io lo g y a nd M o leeu la rB io lo g y R ev iew s，20 0 7 7 1 (4 ):6 53 .)1.1.2 龋 病 的介 绍口腔 的健 康 和 疾 病 状 态 主 要 是 口腔 内微 生 物 群 体 与 宿 主 ( 人 体 )互 作 作 用 的 结 果 。 龋 病 的发 生 有 以下 几 个 因素 : 自身

45、因 素 、生 物 学 因素 、环 境 因素 、行 为 因素 和 生 活 方 式 ，具体 而言 ，是 由高含 量 的 致 龋 细 菌 、不 充 足 的唾 液 流 量 、氟 化 物 不 足 、 口腔 卫 生 习惯 不 良、 不 适 当 的 饮 食 习惯 以及 生 活水 平 低 下 。 在 过 去 的 4 0 年 里 ，通 过 分 离培 养 鉴 定 ，超 过 2 50 种 的 口腔 内细 菌 已被 人 熟知 ，而 通 过 独 立 于 培 养 的分 子 生 物 学方 法 已经 鉴 定 了超 过 45 0 种 的细 菌 I4。研 究发 现 ，牙 菌 斑 是 一 种 具 有 复 杂 结 构 和 功 能 ， 由细 菌 组 成 的 生 物 膜 ，是 龋 病形 成 所 必 须 的 。L 13 口