依达拉奉的多晶型研究

1、依达拉奉的多晶型研究邢逞 杨海光 张丽 杨世颖 杜冠华吕扬 北京协和医学院中国医学科学院药物研究所药物晶 型研究中心晶型药物研究北京市重点实验室北京协 和医学院中国医学科学院药物研究所药物筛选研究 中心药物靶点研究和新药筛选北京市重点实验室摘要：目的研究依达拉奉多晶型现象，寻找对临床有效的优势药用晶型。方法 通过多 种物理或化学方法制备获得依达拉奉的4种晶型样品，釆用单晶x射线衍射技术 （sxrd）、粉末x射线衍射技术（pxrd）、差示扫描量热技术（dsc）、红外光谱 分析技术（1r）与熔点技术（mp）对上述4种晶型样品进行表征;通过多种影响 因素实验对晶型样品的稳定性进行评价;sd大鼠灌胃给

2、予不同晶型依达拉奉， 采用高效液相色谱法检测不同时间大鼠血药浓度变化，比较不同晶型的药动学 特点。结果 通过晶型筛查发现依达拉奉存在4种晶型（晶a型、晶b型、晶c 型、晶d型）,并获得了 4种晶型纯品最佳制备方法;证明pxrd法、dsc法、ir 法均可实现对4种晶型物质状态的表征和鉴别;发现不同晶型会对依达拉奉的稳 定性及药动学产牛影响。结论 通过对依达拉奉多晶型现象进行系统研究，阐明 了其多种晶型样品的物质组成、制备方法、晶型稳定性及药动学特点，确定了依 达拉奉晶a型为优势药用晶型;该研究结果为优势药用晶型的选择和药品质量标 准的提高提拱了数据支持和技术支撑。关键词：依达拉奉;晶型;晶型技术

3、;药动学;作者简介：邢逞（1987-）,女，山东滕州人，助理研究员，在读博士，研究方 向:药物分析。电话e-mail:xingcimm. ac. cno作者简介：吕扬（1959-）；女，北京人，研究员，博士生导师，主耍从事药物分 析研究。电话 e-ma订:luyimm. ac. cn0作者简介：杜冠华（1956-），男，山东滕州人，研究员，博-上牛导师，从事药 物发现、高通量药物筛选、神经药理学和心脑血管药理学研究。电话 e-mail:dughimm. ac. cn。收稿日期：2017-07-06基金：国家重点

4、研发计划(项目编号:2016yfc1000900,课题编 号:2016yfc1000901)research on polymorphs of edaravonexing cheng yang haiguang zhang li yang shiyingdu guanhua lyu yangresearch centre of polymorphic drugs, beijingkey laborstory of polymorphic drug, peking union medical college, institute of materia medica & chinese a

5、cademy of medical sciences; research centre of drug screening, beijing key laborstory of drug targets and screening research, peking union medical college, institute of materia medico & chinese academy of medical sciences;abstract：objective to study polymorphism of the free radical scavenger eda

6、ravone and to find the one which has good advan tages to the cl in ical medica tion. methods preparation of four forms of edaravone through kinds of physical or chemical methods. these polymorphs were characterized by singlc crystal x-ray diffraction method (sxrd) , powder x-ray diffraction method (

7、pxrd) , differential scanning calorimetry method (dsc) , infrared spectrum method (ir) and melting point method (mp) ; a variety of influence factors experiment were used to research the stability of polymorphs. solid edaravone in diffcrcnt foms were orally administcred to sd rats respectively, the

8、plasma concentration of the drug was determined by hplc, and the pharmacokinetic characteristic of different forms was compared according to the hplc results. results four forms (form a, form b, form c, form d) and the preparation of pure crystal forms were obtai ned by crystal screening technology.

9、 these polymorphs were identified by pxrd, dsc and ir. the edaravone polymorphs have an influence on the stability and pharmacokinetic. conclusion edaravone research provideds a variety of crystal material composition， preparation methods, stability， solubility and pharmacokinetic characteristic, an

10、d form a has been proved of good advantage one. this research provides data and technology support for choice of preponderant pharmaceutical polymorphs and drug quality standard improvement.keyword：edaravone; ploymorphism; ploymorphism technology; phaoiacokinctic;received： 2017-07-06依达拉奉(edaravone)是

11、一种自由基清除剂，具有良好的抗氧化活性，2001年 作为治疗脑梗死药物在日木上市。其自由基清除活性表现为通过花牛四烯酸级联 反应，抑制非酶脂质过氧化和脂氧合酶通路，在水溶性和脂溶性环境中均表现 出较好的抗氧化活性。动物实验研究表明，依达拉奉能有效缓解大鼠脑缺血-再 灌注所致脑水肿和神经功能缺损，延迟神经细胞死亡1-3。目前已有多个专利 对依达拉奉的不同晶型进行了保护4-9,但已报道的有关依达拉奉晶型的专利 文献对其晶型的分类及命名较混乱，鉴于依达拉奉药物的质量标准中未涉及多 晶型科学问题，且依达拉奉的水溶性不好，笔者对依达拉奉开展了系统的多晶 型研究，进而对依达拉奉晶型进行系统分类和命名。笔者

12、通过晶型筛查技术发现了依达拉奉4种品型物质存在状态，优化了4种纯品 型物质的制备方法。采用单晶x射线衍射技术方法获得了晶a型纯品的定量数据, 通过理论计算获得其晶态晶型纯度为100%的样品标准粉末x射线衍射图谱数据; 采用粉末x射线衍射分析方法表征了 4种晶型的物质状态;采用差示扫描量热法、 红外光谱法、熔点法可有效实现对依达拉奉4种晶型物质的表征也尘1。通过 整体动物实验证明依达拉奉晶型物质状态对其生物学作用可产生一定的影响。本 研究结果对依达拉奉的晶型质量控制提供了有效分析方法和科学数据吐 1仪器与试药1.1仪器与实验条件(1)单晶 x 射线衍射法(single crystal x-ray

13、 diffraction method, sxrd): 日本理学rigaku micro max 002+单晶x射线衍射仪。实验条件为采用cu k辐 射(1.541 84 ),共聚焦单色器，准直光管直径d二0.30 mm,晶体与ccd探测 器距离d=45 mm,管压45 k v,管流0. 88 m ao结构解析和结构精修采用 shclxs-97 完成。(2)粉末 x 射线衍射法(powder crystal x-ray diffraction method, pxrd) : fl本理学rigaku d/max-2550粉末x射线衍射仪。实验条件为 采用石墨单色器，cu ka辐射(1.541 8

14、4 ),管压为40 k v,管流为150 m a, 扫描步长为0. 02° ,扫描速度为8。- min,发散狭缝为1 ° ,接收狭缝为0. 15 mm,防散射狭缝为1。,扫描范围为3。80。实验样品经研磨并过筛孔内径 (150±6. 6) m (100 s)筛，精密称量样品50 mg检测。(3)差示扫描量热 法(differential scanning calorimetry method, dcs):瑞士梅特勒公司 dsc-1 型差示扫描量热仪标准40 ul氧化铝(aloj w,升温速率为10°c - min, 升温区间：30180°c。精

15、密称取样品23 mg于铝1 甘烟中检测。(4)红外光谱法 (infrared spectrum method, ir):美国 pe 公司 ft-ir/ft-nir spectrometer 红外光谱仪，atr附件，扫描范围4 000=650 cm。 (5)熔点法(melting point method, mp):天津市天大天发科技有限公司yrt-3型熔点仪，升温速率 1°c -mirio (6)高效液相色谱仪:美国安捷伦科技公司agilent 1200高效液相 色谱仪。色谱柱:agilent eclipse xdbcl8 (4.6 mmx250 mm);流动相:水-甲醇 (40 :

16、 60);流速:1 m l - min;柱温:30°c;检测波长:243 nm;进样量:20ulo (7) 离心机:德国eppendorf公司minispi n离心机，转速13 400 r min。漩涡混匀 器:上海凡劲仪器设备有限公司vortex-genie2漩涡混匀器。移液器:德国 eppendorf公司。xs105型电子天平:瑞士梅特勒托利多公司，感量:0. 01 mg。1.2试药依达拉奉原料样品购于湖北众诚科技有限公司，化学纯度均大于99.0%,批 号:0812089o甲醇、乙腊均为色谱纯，屈臣氏蒸憎水，其他试剂均为分析纯。1.3动物无特定病原体(spf)级sd大鼠，雄性，北

17、京维通利华公司，实验动物合格证 号:scxk (京)2009-0807,体质量 220240 go2方法与结果2.1晶型样品的制备晶a型样品的制备:取依达拉奉样品1 g,加入甲醇50 m l,溶解完全后50°c减 压快速去除溶剂，室温减压干燥2 h,获得样品。晶b型样品的制备:取依达拉奉样品1 g,加入95%乙醇50 m l,溶解完全后加 入石油储1 000 m l,待沉淀完全析出后过滤，室温减压干燥2 h,获得样品。晶c型样品的制备:取依达拉奉样品1 g,加入乙月青-丙酮(1 ： 1)的混合溶剂30 m l, 50°c水浴加热助溶，溶解完全后室温静置，待结晶完全析出后过滤

18、，室温 减压干燥2 h,获得样品。晶d型样品制备:取依达拉奉样品1目加入四氢咲喃-石油瞇仃：1)混合溶剂 80 ml, 50°c水浴加热助溶，溶解完全后室温静置，待固体完全析出后过滤，室 温减压干燥2 h,获得样品。2.2晶型样品的表征 2. 2. 1 sxrd采用sxrd获得了依达拉奉晶a型的晶体学数据。衍射实验用晶体为无色透明块 状，晶体大小为0. 32 mmxo. 43mmx1.29 mm,晶体属单斜晶系，空间群为p2】/c,晶胞参数：沪 10.333 (5), b二 11.185 (5), c=15. 878 (8), b 二95. 25(2) ° ,晶胞体积v=1

19、 827 (1),品胞内分子数z=8。图1为依达拉奉晶a 型的立体结构投影图、双分子叠合图、晶胞堆积图。依达拉奉晶a型在晶态下以氢键及范德华力维系其在空间的稳定排列。依达拉奉 晶a型样品的分子氢键值见表1。由于c厂n单键旋转和g位末端拨基的振动，造成分子构象不断变化，因此构象 变化是形成多晶型原因之一。单晶x射线衍射分析法研究使用一颗单晶体，故该 研究数据结果能体现该种晶型样品的100%晶型纯度结果。图1依达拉奉晶a型立体结构投影图(a)、双分子叠合图(b)与晶胞堆积图 (c) fig. 10ak ridge thermal-ellipsoid plot diagram (a) , bimol

20、ecular overlay diagram (b) and packing drawing (c) of edaravone form a 下 载原图表 1 依达拉奉晶 a 型的氢键值 tab. 1 hydrogen bond lengths () of edaravoneform a下载原表晶型种类d-hd(h.a)晶a型n 44n2b-ll2ba1.980n -hn2a-12aa2.0402. 2. 2 pxrd 利用依达拉奉的晶a型样品的单晶x射线衍射数据，通过理论计算可获得晶型纯 品的理论粉末x射线衍射图谱。图2为依达拉奉4种晶型理论和实验粉末x射线 衍射图谱。依达拉奉4种晶态晶型前

21、10位主强峰比对数据见表2。采用粉末x射线衍射法对获得的4种依达拉奉晶型样品进行分析，发现依达拉奉 晶a型的实验粉末x射线衍射图谱与理论粉末x射线衍射图谱一致，表明实验制 备的粉末样品为品a型纯品。依达拉奉4种晶型的粉末x射线衍射图谱在衍射峰 位置和相对峰强度均有显著差别，该方法可以有效鉴别依达拉奉的不同晶型物 质状态。2. 2. 3 dsc采用dsc对依达拉奉4种晶型样品进行了表征，图3为dsc图谱，表3为不同晶 型样品的吸热峰位置。3()40506070802913()4050607080图2依达拉奉理论4种晶型粉末x射线衍射图谱fig. 2 pxrd patterns of four e

22、daravone pol ymorphs下载原图1晶a型理论粉末图谱;2.晶a型实验粉末图谱;3晶b型实验粉末图谱;4.晶c 型实验粉末图谱;5.晶d型实验粉末图谱1. simulated pxrd pattern of form a;2.experimental pxrd pattern of form a;3.experimental pxrd pattern of form b;4. experimental pxrd pattern of form c;5 experimental pxrd pattern of form d表2依达拉奉4种晶态晶型前10位主强峰数据tab. 2 to

23、p 10 main strong peaks data of four edaravone polymorphs下载原表峰号晶a型d(a)1/1。14.191 3100.024.539 272.533.671 666.344.125 956.354.667 355.868.051 051.876.642 148.483.536 540.794.951 538.4103.388 438.3图3依达拉奉4种品型样品的dsc图谱fig. 3 dsc spectra of four edaravone polymorphs下载原图表3依达拉奉4种晶型样品dsc峰值数据tab. 3 dsc result

24、s of four edaravone polymorphs卜载原表晶型起始温度熔融温度能°c晶a型126.35128.01尸96.27104.80晶b型120.97124.74晶c型141.48148.27l晶d型113.30116.12116.81117.51126.46127.55a通过差示扫描量热分析可知，依达拉奉晶b型除了熔融峰之外述有一个吸热峰 为溶剂峰。晶d型存在一个转晶点。4种不同晶型物质间dsc图谱的吸热峰数目、 位置和强度存在一定差异，表明利用dsc分析技术可实现对依达拉奉4种不同晶 型物质的鉴别。2. 2.4 ir采用1r表征依达拉奉4种品型物质状态，其中晶a型

25、红外吸收峰为3 129, 3 056, 3 029,2 924,2 559,2 123,1 805, 1 597, 1 58& 1 578, 1514, 1495, 1455, 1386, 1366, 1342, 1329,1 313, 1 302, 1235,1 197,1 160,1152,1 073,1 044,1 027,1 015,917,896, 846, 833,802,775, 764, 749,710,691, 682 cm;晶 b 型红外吸收峰为 3 246, 3 126, 3 058, 3 029, 2 983, 2 926,2 511, 2 415, 1 791

26、, 1 713, 1 590, 1 553, 1 524, 1 498, 1 452, 1 387, 1365, 1346, 1327, 1314, 1251,1 198, 1 183, 1162,1 141,1 074,1049,1 032, 1 016, 998, 973, 961, 917, 90& 80& 771, 752, 711, 683 cm;晶 c 型红外吸收峰为:3 228, 3 060, 2 977, 2 908, 2 869, 2 792, 2 742, 2 616,2 532, 2 456, 1 78& 1 692, 1 609, 1 596,

27、1 557, 1 538, 1 520, 1 497, 1 455, 1 395, 1 365, 1 306, 1 278, 1 231, 1 19& 1 162, 1 146, 1 085, 1 076,1 063, 1 033, 1 017, 979, 957, 918, 909, 894, 836, 825, 805, 781, 766,751, 744, 711, 691, 683, 653 cm;晶 d 型红外吸收峰为:3 245, 3 126, 3 059, 2 925, 2 852, 2 790, 2 712, 2 610, 2 527, 2 423, 1 791, 1

28、704, 1 595, 1 557, 1 531, 1 497, 1 455, 1 386, 1 366, 1 344, 1 307, 1 247, 1 19& 1 161, 1 153, 1 136, 1 070, 1 046, 1 031, 1 018, 1 004, 981, 961, 917, 907, 83& 808, 750, 712, 687 cm。图4为依达拉奉4种晶型样品的红外光谱图。采用红外光谱分析结果表明，依达拉奉4种晶型的红外吸收光谱间存在较大差 异，主要是由于分子间作用力的不同及溶剂分子的介入导致4种晶型的红外205 0 5 0 5 o 5 o 5 o

29、 5 o 1 lo9 9 8 8 7 7 6 6 5 5 4 斗5. o1 3;- ()()数2()波()(70 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 2m lo 9 9 8877665544 3 l4 o1 3 1 o56()()3图4依达拉奉4种晶型样品的红外光谱图fig. 4 tr spectra of four edaravone polymorphs下载原图2. 2. 5 mp采用mp研究依达拉奉4种晶型物质热能变化特征，4种晶型的初熔值、终熔值 等信息见表4。吸收光谱间存在较大差异。利用红外吸收光谱可有效鉴别依达拉 奉的4种晶型物质。表4依达拉奉4种晶型熔点值表tab

30、. 4 melting points of four edaravone polymorphs下载原表晶型初熔终熔晶a型126.9127.7晶b型127.7128.6晶c型133.9134.8晶d型128.3129.1熔点分析结果表明，依达拉奉晶a型、晶b型、晶c型、晶d型的熔距值均小于 1°c,表明4种晶型样品的晶型纯度好;从表4可以看出，依达拉奉晶c型与其它 3种晶型的熔点值差距较大，可利用熔点法有效鉴别依达拉奉的晶c型。2. 3晶型成药性评价2. 3. 1稳定性评价将依达拉奉4种晶型样品置于高温(60±2) °c、高湿相对湿度(90±5) %、 光

31、照(4 500土500) lx条件下放置10 d,于第5天、第10天分别取样进行粉末 x射线衍射分析。通过影响因素实验，考察依达拉奉4种晶型在高温、高湿和光 照条件下的稳定性，发现晶a型、品c型、晶d型为稳定晶型，晶b型为亚稳定 晶型，在高温、光照条件下可向晶a型转变。实验结果见表5。2. 3. 2药动学评价(1) 溶液配制 依达拉奉标准储备液:精密称取依达拉奉样品5 mg置于5 m l量 瓶，加入乙月青将样品溶解并定容，配成lnignil标准储备溶液，备用。内标溶液配制:精密称取卡马四平标准品1 mg,用乙膳充分溶解，配制成100 p g m l 备用。(2) 血浆处理方法精密移取大鼠血浆1

32、00 ul,置于1.5 m l离心管，加入内标 10ul和乙月青90ul,沉淀蛋白,震荡3 min,离心(13 400r min, 10 min, r=6 cm),然后吸取上清液进样20ulo（3）标准曲线的绘制分别配置依达拉奉浓度为1, 2, 5, 10, 20, 50 p g m l 系列血浆，按照“（2） ”项下血样处理方法处理样品，在相应液相条件下测定, 重复3次，以依达拉奉峰面积（y）对依达拉奉浓度（x）作线性冋归，得 y=0. 237x-0. 063, r二0. 999。（4）动物给药及取血取sd大鼠24只，禁食不禁水12 h,固体灌胃给予依达拉 奉100 mg - kg,给药后每

33、只鼠立即灌胃给予水2ml,然后分别于5, 10, 15, 30 min, 1, 2, 3, 4, 6, & 12, 24 h经眼内眦取血，置肝素化试管，离心，取上 层血浆100 ul,然后按所述方法进行样品处理与测定。晶型样品的药动学参数 见表6,药-时曲线见图5。表5依达拉奉4种晶型样品稳定性考察结果tab. 5 stability of four edaravone polymorphs下载原表晶型咼温实验第5天晶a型稳定稳定晶b型晶b型为主，少量晶a型晶b型晶c型稳定稳定晶d型稳定稳定表6依达拉奉晶型样品的药ztab 6 pharmacokinetic parametei pol

34、ymorphs晶型auc(w /(|jig * l-1 h)晶a型18.994±2.786晶b型13.851±2.662晶c型11.120±2.394晶d型9.842±2.847晶型t /maxh晶a型0.458±0.102晶b型0.708±0.641晶c型0.417±0129晶d型0.375±0.137t/h图5依达拉奉4种晶型样品药t寸fig. 5 plasma concentration-t edaravone polymorphs (x±s,n= 6)以上结果表明，大鼠灌胃给予依达拉奉不同晶型后在

35、体内同一时间点的血药浓 度存在一定差异，表明不同晶型物质状态在大鼠体内的吸收量和吸收速率存在 一定差异。依达拉奉晶a型样品从吸收量和速度均表现出一定优势，其血药浓度 峰值最高，晶b型血药浓度峰值仅为晶a型的3/4,晶c型、晶d型更次，故依 达拉奉晶a型属该药物优势药用晶型物质。3讨论笔者釆用多种晶型筛选技术获得了依达拉奉的4种晶型物质状态。采用x射线衍 射技术、差示扫描量热分析技术、红外光谱分析技术、熔点分析技术分别对依达 拉奉4种晶型物质进行了表征，证明不同原理方法可实现对晶型物质的鉴别的 目的。稳定性实验表明依达拉奉的晶a型、晶c型、晶d型为稳定晶型。药动学 实验表明，不同晶型样品在大鼠体

36、内的血药浓度和吸收速率存在一定的差界， 其中晶a型有显著优势。因此判断依达拉奉晶a型为优势药用晶型。本研究结果表明，依达拉奉的不同晶型状态直接影响药物稳定性与口服吸收后 的血药浓度，但口前我国尚未对生产的依达拉奉进行晶型质量控制，这可能是 影响其临床疗效的因素之一，本研究结果可为依达拉奉质量标准提高和晶型质 量控制提供研究数据和技术支持。参考文献1 qiang x m, li y, yang x, et al. dl-3-n-butylphthalideedaravone hybrids as novel dual inhibitors of amyloid-b aggregation and monoaiiiinc oxidases with high anti oxida nt potency for alzhei