PMA对少突胶质细胞铁相关蛋白表达的影响

1、    pma对少突胶质细胞铁相关蛋白表达的影响    杜臣臣谢俊霞王俊摘要目的 探讨4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯（pma）对未分化和分化的mo3.13少突胶质细胞铁相关蛋白表达的影响。方法将mo3.13细胞分为对照组和pma组。对照组用基础培养液进行细胞培养，pma组的培养液内加入终浓度为100nmol/l的pma，每3d换1次液。培养7d后，采用蛋白质免疫印迹实验检测两组细胞转铁蛋白受体1（tfr1）和铁调节蛋白1（irp1）的表达水平。结果与对照组相比，pma组细胞tfr1和irp1的表达水平均显著降低（t=3.002、2.654，p

2、<0.05）。结论100nmol/l的pma可引起少突胶质细胞tfr1和irp1的表达降低，这种变化可能与irp1的调节有关。关键词乙酸盐类;少突神经胶质;受体，转铁蛋白;铁调节蛋白质1r338.2文献标志码a2096-5532（2020）01-0014-03帕金森病（pd）是一种常见的神经退行性疾病，其主要临床表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势反射异常等1-2。有研究结果表明，铁沉积和氧化应激是pd的两个主要的病理特征3-4。铁对于细胞发育和维持中枢神经系统的各个生理过程至关重要，例如氧气运输、dna合成、线粒体呼吸、髓磷脂合成和神经递质代谢等5-6。少突胶质细胞是中枢神经系统中

3、形成髓鞘的细胞，它是由少突胶质细胞前体细胞（opcs）分化而形成的7-8。铁蛋白是中枢神经系统中的主要储存蛋白，且在少突胶质细胞中检测到最高表达水平。因此，少突胶质细胞也是中枢神经系统中重要的铁调节细胞9-11。4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯（pma）是一种广泛用于体内外实验的蛋白激酶c（pkc）激活剂，它可以结合pkc，并激活pkc，随后导致一系列的细胞反应。有研究结果表明，未分化的mo3.13细胞在加入含100nmol/l的pma的无血清培养液中培养7d后，检测到髓磷脂碱性蛋白（mbp）的免疫反应性大幅度上调12。然而，pma是否影响少突胶质细胞内铁相关蛋白的表达，目前仍不清楚

4、。本实验旨在探讨pma对mo3.13少突胶质细胞内铁相关蛋白表达的影响，从而为pd的防治提供实验依据。现将结果报告如下。1材料与方法1.1材料mo3.13少突膠质细胞购自于上海拜力生物科技有限公司。dmem高糖培养基、胰酶均购自美国hyclone公司，胎牛血清（fbs）购自gibco公司，pma、兔抗属单克隆一抗转铁蛋白受体1（tfr1）和铁调节蛋白1（irp1）均购自sigma公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg二抗购自absin公司，青霉素-链霉素溶液（100×）购自江苏海门碧云天生物技术研究所，bca蛋白定量检测试剂盒为thermo公司产品。所使用的仪器包括co2培养箱、超

5、净工作台和western显影仪等。1.2细胞培养及分组将放置在液氮中的未分化mo3.13少突胶质细胞冻存管快速转移至37恒温水浴锅中进行融化。在超净工作台中将融化的未分化mo3.13少突胶质细胞从细胞冻存管中吸出，转至离心管中，再补入10ml的mo3.13少突胶质细胞完全培养液，用于稀释冻存液中的有害成分。将离心管放于离心机中，以1000r/min离心5min，沉淀细胞。弃上清，重新加入细胞培养液，用滴管吹打细胞后转入细胞培养瓶中，置于37、含体积分数0.05co2的细胞培养箱中培养。当培养瓶中的细胞长至90%融合时，将细胞接种于6孔细胞板中，用mo3.13少突胶质细胞完全培养液培养24h，将

6、原有的细胞培养液弃掉，加入含100nmol/lpma的无血清培养液，置于37、含体积分数0.05co2的细胞培养箱中培养。每3d换1次液，培养7d后，采用免疫荧光摄片的方法检测到成熟少突胶质细胞的标记物mbp的表达率大于90%，证明未分化的mo3.13少突胶质细胞分化成分化的mo3.13少突胶质细胞。本实验将细胞分为对照组（未分化的mo3.13少突胶质细胞）和pma组（分化的mo3.13少突胶质细胞）。1.3蛋白质免疫印迹实验检测铁相关蛋白表达提取两组细胞蛋白，用bca蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，根据蛋白浓度计算每个样本的上样量。蛋白经sds-page电泳后转移至pvdf膜上，采用100g/l

7、的脱脂奶粉室温封闭2h，再分别加入-actin（110000）、tfr1（11000）和irp1（11000）抗体，4下在摇床上孵育过夜。以tbst洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg二抗，室温下在摇床上孵育1h。再以tbst洗膜3次后，用ecl发光剂显影。应用imagej软件分析条带灰度值，结果以tfr1/-actin和irp1/-actin的比值表示。实验重复3次。1.4统计学分析应用graphpadprism5.0软件进行统计学处理，结果以akx-d±s表示，两组间比较采用t检验。2结果结果表明，pma组细胞tfr1和irp1蛋白的表达水平均明显低于对照组，差异均

8、有统计学意义（t=3.002、2.654，p<0.05）。见表1。3讨论铁是生物体正常代谢所必需的微量元素，对大脑的发育至关重要2，13。不同的神经胶质细胞由不同的铁相关蛋白来调节细胞对铁的摄取。在人类中，无论是未分化的还是分化的少突胶质细胞，铁的转入都是通过tfr1介导转铁蛋白（tf）或铁蛋白的摄取14-15。tfr1也被称为cd71，是一种型跨膜糖蛋白，在细胞表面上广泛表达，是介导细胞内铁摄取的主要受体16。有研究表明，tfr1是细胞铁稳态的关键调节剂，是参与铁吸收和细胞生长调节的必需蛋白质17-18。irps是铁代谢相关蛋白转录后调节的最重要的因素19。在铁缺乏期间，irp1通过与

9、铁反应元件（ire）的一小部分mrna转录物结合来提高铁水平，从而调节其翻译并维持体内铁的稳态20。irp1与ire结合可以抑制mrna的翻译或增加mrna的稳定性。当前的研究发现，ire结构存在于tfr1mrna的3非翻译区。当irp1与ire结合时，tfr1mrna的稳定性将得到提高，进而增加tfr1的表达21。本实验结果表明，pma可同时降低分化的少突胶质细胞irp1与tfr1的蛋白表达。推测pma首先通过降低细胞irp1的表达，进而使irp1与tfr1mrna的3非翻译区的ire结合率降低，从而降低细胞tfr1的表达，但其机制还有待进一步研究。少突膠质细胞的发育和成熟需要一系列相互作用

10、来调控opcs的增殖和分化以及髓鞘的形成，而铁在这一过程中起到了决定性的作用22。少突胶质细胞需要铁参与髓鞘生成和作为酶的辅酶因子23。有研究表明，铁缺乏会对细胞周期起抑制作用，但当铁浓度超过一定的阈值后，增殖就会停止，分化就开始了。当增殖的opcs暴露于高水平的铁时，细胞停止分裂并进行分化24。tfr1是少突胶质细胞中唯一调控铁转入的蛋白，本实验结果显示，用pma对未分化的mo3.13细胞进行分化后，tfr1和irp1的表达显著降低。分化的mo3.13少突胶质细胞的tfr1表达降低，表明分化的少突胶质细胞铁转入能力降低。故本文结果表明，未分化的mo3.13少突胶质细胞对铁的吸收能力大于分化的

11、mo3.13少突胶质细胞，分化后的少突胶质细胞对铁的需求减少，不会再摄取更多的铁。本实验结果为pd的治疗提供了新的思路和靶点。参考文献1liantenghong，guopeng，zuolijun，etal.tremor-dominantinparkinsondisease：therelevancetoironmetabolismandinflammationj.frontiersinneuroscience，2019，13：255.2peschb，casjenss，woitallad，etal.impairmentofmotorfunctioncorrelateswithneurometabo

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