植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选

1、第八章植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选第一节植物细胞悬浮培养体系的建立和愈伤组织诱导与植株再生一、植物细胞悬浮培养的定义植物细胞悬浮培养（Plant cell suspension culture ），是指将植物细胞或小的细胞团（包括含少数细胞的小的分生细胞团或细胞聚集体）放在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。这些细胞或小的细胞团来自愈伤组织，或某个器官或组织，通过物理或化学的方法进行分离而获得。二、建立一个良好细胞悬浮培养体系应具备的条件建立一个成功的细胞悬浮培养体系（简称悬浮细胞系）必须满足三个基本条件： 细胞或小的细胞团在液体中分散性良好，小细胞团在几十个细胞以下。很少有完全由 单细胞组

2、成的悬浮细胞系。 均一性好，即细胞形状、大小及细胞团大小均匀一致。在倒置显微镜下观察，悬浮细 胞系内的细胞团体积和形状比较一致。 液体培养基中细胞分裂旺盛，细胞生长迅速，一般23天生长量可增加一倍。植物悬浮细胞系不仅为原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础，同时也为遗传转化提供良好受体，还可以用来生产植物次生代谢产物。因此，植物细胞悬浮培养是植物细胞工程技术中很有价值的技术手段。三、建立良好悬浮细胞系的技术关键影响建立良好悬浮细胞系的主要因素，见图6.1。图6.1影响建立良好悬浮细胞系的主要因素1. 选择合适的基因型和外植体（1）基因型基因型是影响植物细胞悬浮培养成功的重要因素。有的基因型

3、容易诱导形成愈伤组织，用其为外植体进行细胞悬浮培养，细胞可以进行分裂，并可持续分裂，进一步同步化后，获得悬浮培养细胞系。但有的基因型则与之相反。因此，要重视起始材料基因型的筛选。（2）外植体选择合适的外植体是细胞悬浮培养成功的另一重要因素。外植体的选择对以后愈伤组织的诱导十分重要，是愈伤组织诱导的重要条件。合适的外植体诱导产生疏松易碎愈伤组织， 对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。双子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶和叶片等；单子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、幼穗和花药等。根据大量的研究报道，无论单子叶还是双子叶植物均以幼胚（单子叶植物的幼穗也很好）为最佳，诱导的

4、愈伤组织质量好，分化能力强。某些情况下用幼胚、下胚轴、子叶等可以直接 进行细胞悬浮培养，如用大麦幼胚可以直接建立悬浮细胞系，并利用此细胞系获得大麦原生质体再生植株（颜秋生等，1990）。东北农业大学小麦研究室曾用小麦幼穗诱导产生愈伤组织，再以愈伤组织为外植体成功地建立单细胞悬浮培养细胞系，进一步诱导培养获得再生植株（见图6.2 ）,并对其后代的农艺性状、生化品质性状以及遗传稳定性进行研究。这充分表明体细胞无性系变异的存在和在作物品种改良中应用的可行性（李文雄，曾寒冰，胡尚连，19892002）。1 , 2同步化悬浮培养细胞分裂前；3第一次正常分裂；4非正常分裂的第一次分裂；5, 6非正常分裂的

5、第二次分裂；710经多次分裂后形成细胞团；11, 12愈伤组织；13愈伤组织芽的分化；14由愈伤组织直接发生的再生植株；15移栽的再生植株图6.2 小麦单细胞培养与植株再生（李文雄，曾寒冰，胡尚连，1996）2. 诱导疏松易碎的愈伤组织愈伤组织质量（外观和生理状态） 直接影响悬浮细胞系的建立。最合适的愈伤组织应疏松易碎、外表湿润、 颗粒细小，颜色为白色或淡黄色，经几次继代筛选后作为建立悬浮细胞 系的起始材料。诱导疏松易碎的愈伤组织，关键在于培养基类型、激素的种类和浓度， 以及外植体本身和附加的有机物。对于禾谷类作物来说，适宜的外植体为幼穗、幼胚和花药，激素一般为2mg/L2, 4-D （或附加

6、0.5 mg/L BA NAA或 ABA）,常以 MS Bs或N6为基本培养基。在培养基中附 加有机物有利于愈伤组织的诱导。如加入水解酪蛋白、L-脯氨酸、谷氨酰胺有利于疏松易碎愈伤组织的诱导， 这主要是改变培养基中 NH 4 n和NO_ N的比例。它们的比例的改变 影响愈伤组织的质量和状态。另一重要因素是培养基渗透压。培养基中蔗糖浓度为1030g/L时，有利于疏松易碎愈伤组织的形成，浓度较高时则易形成坚硬的愈伤组织和胚状体。此外，调整继代时间间隔可使疏松易碎愈伤组织块生长迅速，很快从大块组织块中分离出来。因愈伤组织内部的细胞不均一， 生理状态和生长速度也不相同， 疏松易碎的小愈伤组 织块常被包

7、埋在大愈伤组织块内。3. 选择合适的细胞悬浮培养基用于细胞悬浮培养的培养基可参考愈伤组织诱导培养基，但有时并不完全适合细胞悬浮培养。当培养过程中细胞变褐、生长变缓时应重新选择培养基，包括选择培养基的种类，激素的种类、浓度、比例，以及有机附加物等。对单子叶植物而言，一般选择MS B5和2培养基，而对双子叶植物，一般选择MS R、LS和SL培养基。并根据培养状况调整培养基中激素种类、浓度和比例及有机附加物等。由于悬浮细胞在液体培养基中生长迅速，容易造成pH值下降，应及时更换新鲜培养基。一般每35天更换1/3培养液。也可以在培养基中添加pH值缓冲剂，如 MES（ 2-吗啡啉乙基磺酸）等。4. 培养基

8、灭菌用于细胞悬浮培养的培养基通常用微孔滤膜过滤。一般不采用高压灭菌，因高压易使培养基中的某些成分被破坏，使pH值发生改变，并常有沉淀物产生。5. 细胞悬浮培养开始进行细胞悬浮培养时，取约2g新鲜疏松易碎愈伤组织于盛有 2040 mL液体培养基的三角瓶内，在摇床上 120 r/min、25 P± 1乙、黑暗或弱光条件下培养（见图 6.3 ）。如果愈 伤组织不易分散，可先用镊子将愈伤组织碎开，碎开时尽可能避免损伤。培养过程中可能出 现悬浮细胞培养物呈粘稠状而影响细胞生长的情况，可以通过短间隔（23天）的继代培养加以解决。2040 mL培养基图6.3 细胞悬浮培养与植株再生过程示意图提示：

9、 细胞悬浮培养过程中要注意细胞与培养基的比例，以120 r/mi n条件下细胞可在培养液中浮起为宜；新配好的培养基应放置数天，确定无污染时才能使用。6. 悬浮细胞的继代与选择细胞悬浮培养刚开始时细胞生长较慢，原来许多较小的细胞团逐渐变大，同时又有新的小细胞团产生。为了细胞培养的同步化，必须将培养一段时间后的培养液中大块愈伤组织和细胞团去掉，保留小的细胞团，直至得到均一的细胞悬浮培养体系为止。常用的方法有三种： 采用尼龙网或不锈钢网（孔径 520左右）过滤去掉大块愈伤组织或大细胞团，然后 收集小细胞团进行继代培养；在每次进行继代培养时将培养物摇匀，静止片刻，将上层液体培养基与其中的小细胞团倒入另

10、一无菌三角瓶内，弃去大细胞团和位于瓶底部的愈伤组织块，加入新鲜培养基进行继代培养；将培养物摇匀，静止片刻，用吸管吸取培养基中部培养物（此处细胞团小而均一，胞质浓厚），加入另一无菌三角瓶中，然后添加无菌新鲜培养基。提示：进行继代培养时应注意培养瓶内原有的培养基和新鲜培养基的比例，一般以1:3为宜。因为培养瓶内原有培养基经过短时间细胞培养后具有促进细胞分裂的作用（Somers等，1987）。操作过程中应避免污染。7. 悬浮细胞的同步化经过上面的处理和多次继代筛选后的悬浮细胞系的均一性是相对的， 其中包含十几至几 十个细胞的细胞团， 还不适合用于诱导体细胞胚发生及生理生化机制的研究， 仍需进一步分

11、离使其同步化。 可通过分级过筛分离法和不连续密度梯度离心法达到。 分级过筛分离法采用 不同孔径尼龙网， 根据细胞团的大小将各组分分开。 不连续密度梯度离心法是根据细胞团各 组分比重的不同而将其分开。 Ficoll 是蔗糖的多聚物，常被用作密度梯度系统。不同孔径 尼龙网分级过筛方法简单， 效果也好。 尼龙网可多次使用， 但每次使用后应彻底清洗和灭菌。8. 悬浮细胞的活力和生长速度 悬浮细胞的活力和生长速度受悬浮培养细胞起始密度的影响。 当悬浮培养细胞生长积累 到一定量时， 必须通过继代将其分开， 并加入一定量培养基使细胞继续进行生长， 并保持细 胞应有的活力。 一般继代培养 3 天时的细胞活力最

12、强， 常以其为材料进行原生质体游离与培 养和诱变处理等。如果继代时间过长（57天或更长），瓶内细胞积累量过多时，细胞自身向培养基中分泌产物增多，而且培养基成分和 pH 值均发生较大变化，往往造成细胞活力下 降，细胞生长缓慢。细胞活力测定可用酚藏花红染色法和二醋酸荧光素染色法（Widholm ， 1972）及氯化三苯四氮唑还原法（ Sakai ， 1982）进行测定。悬浮细胞生长速度的测定无统一标准和方法， 通常是测不同时间细胞的鲜重、 干重或密度积 累，以此作为衡量生长速度的标准。提示： 由于悬浮培养细胞起始密度是影响细胞生长速度的一个重要因素，因此在测量时应加以考虑。9. 悬浮细胞愈伤组织的

13、形成和植株再生悬浮培养细胞的分裂和分化通常有两个途径， 一是直接形成体细胞胚； 二是先诱导形成 肉眼可见的愈伤组织， 然后通过愈伤组织进一步诱导植株再生。 后者较常见。 下面是通过第 二种途径进行愈伤组织诱导和植株再生的方法。 平板培养法，指将制备好的细胞悬浮液按照一定的细胞密度分布在1 mm厚的薄层固体培养基上进行培养。为便于培养和观察，有时也可采用半固体培养基进行悬浮细胞培养。 这种方法的优点是易于在显微镜下进行细胞分裂和细胞团形成的跟踪观察，便于细胞突变体的筛选。 看护培养法。有些植物细胞一旦被分离出来后，很难进行分裂和增殖，有可能导致 死亡。因此，常在细胞悬浮培养过程中用一块愈伤组织来

14、哺育细胞， 促使其进行分裂和增殖， 这就是看护培养法。 这种培养方法的优点是易于操作， 但不能在显微镜下进行细胞分裂和细 胞团形成的跟踪观察。 微室培养法，指将悬浮细胞培养在培养板的培养室中，使其分裂增殖形成细胞团的方法。这种方法的优点是可以在显微镜下跟踪观察细胞分裂增殖形成细胞团的全过程，并可进行比较观察试验。由于培养基少，应及时添加和更换培养基，每次更换1/3 。原生质体培养也可采用这一方法。 直接在液体培养基中培养，待出现肉眼可见的愈伤组织时，再将愈伤组织转移到分 化培养基上诱导植株再生。 双层培养，即将培养物分散在固体培养基上，再加上一薄层液体培养基。 悬浮细胞的分化培养基可参考愈伤组

15、织分化培养基。 某些有机物的添加对悬浮细胞再生植株是有益的，如水解酪蛋白、酵母提取液、谷氨酰胺等。第二节 植物细胞培养与次生代谢产物生产、植物次生代谢产物的概念与分类植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物， 其 产生和分布通常有种属、 器官组织和生长发育期的特异性。 次生产物在植物中的合成与分解 过程称为次生代谢。植物次生代谢产物根据分子结构的不同可以分为酚类化合物黄酮类、 单酚类、醌 类（苯 醌、萘醌、蒽醌）、萜类化合物三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、二萜、含氮化合物 生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）、胺类（伯、仲、叔、季胺）、非蛋白质氨基 酸、生氰

16、甙、多炔类以及有机酸等。二、植物次生代谢产物生产的理想途径植物次生代谢产物生产的理想途径是规模化细胞培养，优点是可以保护生态环境、提 高生产效率和 发展新型生物技术产业。其技术要求是： 1. 培养的细胞在遗传上保持稳定，以获得产量恒 定的产物； 2. 细胞生长速度及其生物合成的速度要快，使终产物在较短的时间内获得较高 的产量； 3. 代谢产物最好在细胞中积累而不被迅速分解，而且能够将其释放到培养基中。三、培养系统与植物细胞规模培养技术关键（一）、培养系统1、悬浮培养系统：机械搅拌式培养系统、气压搅拌式培养系统、旋转式培养系统2、固定化培养系统（二）、植物细胞规模培养技术关键1、细胞系的建立与选

17、择； 2、优良细胞系的增殖培养； 3、大规模培养体系的建立四、影响植物次生产物合成的因素1、内因 细胞的遗传特性 母细胞外植体的生理状态2、外因 温度 pH 营养状况 通气状况3、生长调节因子：激素、前体物质第三节 细胞突变体筛选与作物改良一、细胞突变体的概念、特点和用途突变和重组是植物发生遗传变异的前提和基础。一般突变和重组在自然条件下就可以发生， 通过物理和生物化学诱变也可以发生。细胞突变体是指将植物细胞培养在附加一定化学物质的培养基上，用生物化学的方法诱导细胞遗传物质的改变， 从细胞水平上大量筛选拟定目标突变体。 细胞突变体的优点是诱变 数量大，诱变几率高，重复性和稳定性好。它可用于植物

18、的遗传改良及遗传和代谢的研究。、目标细胞突变体的类型和作物改良细胞突变体筛选和作物改良目标密不可分。目前，常通过以下突变体的筛选解决品质、 抗病、抗逆和产量方面的问题： 优质农作物细胞突变体筛选; 抗病细胞突变体筛选； 抗逆境胁迫细胞突变体筛选; 抗除草剂细胞突变体筛选； 营养缺陷型细胞突变体筛选; 高光效细胞突变体筛选； 其他。三、植物细胞突变体筛选方法细胞突变体出现频率很低，因此，必须采用特定的方法将发生突变的细胞从正常型细胞 中分离出来。筛选原理建立在有区别地杀灭正常型细胞的基础上。根据除去正常型细胞方式的不同，可以将筛选方法分为正选择法和负选择法，以及后来发展起来的“绿岛”法。1.正选择法正选择法是指把细胞群体置于某种选择剂中或选择条件下，细胞突变体可以正常生长， 正常型细胞不能生存而死亡，从而达到分离目的的一种选择方法。一般抗性细胞突变体的筛选常采用正选择法，如抗病细胞突变体筛选、抗逆境胁迫（抗盐、抗旱和抗寒等）细胞突变体筛选、抗除草剂细胞突变体筛选等。这种方法大多是直接在 培养基中加入某种能体现细胞突变体特征的物质。如抗盐细胞突变体筛选通常是在培养基中加入一定浓度的盐；抗除草剂细胞突变体筛选是在培养基中加入一定浓度的某种除