猪瘟病毒C柱cDNA文库的构建

1、猪瘟病毒c株cdna构建生命科学学院2000级 田萌摘要猪瘟是感染猪的一种急性传染病，猪瘟病毒(classical swine fever virus, csfv)为引起猪瘟的致病原。csfv是单股正链rna病毒，属黄病毒科、瘟 病毒属。木实验通过rt-pcr技术，分段克隆了弱毒株c株，将全长分为7部分, 并利用一系列限制性内切酶，将7各片段和低拷贝质粒pmc-i8连接在一起，得 到猪瘟病毒c株的cdna全长，为下一步疫苗的研究奠定基础。一.研究背景：猪瘟(hog cholera,或 classical swine fever)是由猪瘟病毒(classical swine fever viru

2、s,csfv或称hog cholera virus)的感染引起的一种猪的急性传染病。 其症状主耍有内脏器官多发性出血、梗塞和坏死，死亡率甚高，是造成畜牧业重 大经济损失的主要传染病。猪瘟病毒在分类学上属于黄病毒科(flavividae)的瘟病毒属(pestivirus). 与它同科的病毒还有人类丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,hcv),牛病毒性腹泻 病毒(bovine viral diarrhoeavirus,bvdv)和羊边界病病毒(bordet disease virus,bdv)o猪瘟病毒的特点是在感染细胞后不引起细胞病变(cytopathic effect,cpe),

3、同 时该病毒具有囊膜，滴度很低，病毒颗粒容易裂解，难以采用cscl密度梯度离 心等常用的病毒分离纯化方法来分离纯化(caij,etal 1993),所以长期以来，对 于猪瘟病毒的研究一直停留在血清学和流行病学的水平上。但近年来，随着单克 隆抗体技术和现代分了生物学技术的发展，研究者已经对于猪瘟病毒及其与宿主 关系的研究屮取得了长足的进展。猪瘟病毒粒子结构，基因组结构及其繁殖过程猪瘟病毒是冇囊摸的正链rna病毒，病毒粒子的直径我40 60nmo囊膜 上有病毒编码的糖蛋白：gp44/4&gp33和gp55o核衣壳有病毒蛋口 pl4和病毒基 因组rna组成，直径约冇30nm(moennig

4、1990。它能够在多种动物细胞屮繁殖, 且不使培养的细胞发生病理变化(殷震和刘景华1997)0csfv是通过受体介导的胞吞作用进入宿主细胞的内部，病毒脱衣壳释放核 酸后，进行其蛋白质的合成和基因组的复制。csfv的基因组rna约为12.3kb, 5 '端无甲基化的“帽了”结构，3'端无poly(a)的“尾”结构，只有一个开放 阅读框(open reading frame, orf),可编码3898个氨基酸的多聚蛋白(meyers,et al.l989;moormann,et al. 1990a; 1990b; 1996)ocsfv 的基因组 rna 可以作为 mrna 指导其蛋

5、白质的合成。csfv orf编码的多聚蛋白在翻译的同吋和翻译后，经宿主细胞和病毒基因 组所编码酶的加工，形成了多个病毒蛋口，包括衣壳蛋口 c、囊膜糖蛋口 erns.ek e2以及许多种非结构蛋白如p7、ns2-3、ns4a、ns4b、ns5ab。nproc e0 el e2 p7 ns2-3ns4a ns4b ns5a-b图1.1 csfv的基因组结构图全长cdna在rna病毒研究中的作用由于dna重组技术在分子水平上的应用，使得人们在分子水平上对基因组进行 分析和修饰成为可能，从而为更深入的了解基因的结构与功能提供了重要的手 段。而由于病毒的基因组相对较小，现代分了生物学实验技术在病毒学研究

6、上的 应用更是十分广泛。由丁病毒仅仅是一段核酸和少量的几种蛋白质组成的介于生 命物质和无生命物质之间的一种存在形式，所以获得病毒的基因组dna和rna 病毒的全长cdna就使得人们研究生命过程的工作变得更加主动。而由于除逆 转录病毒外的rna病毒在其生命周期中没冇dna的阶段，又由于rna分子本 身的不稳定性，及该病毒木身滴度较低和难以分离的特点，所以全长cdna对 于这种rna病毒的研究就显得更加重要。猪瘟的防治和疫苗研究控制病毒病得最好方法是研制疫苗，人类的一些病毒性疾病如天花、麻疹和 小儿麻痹症等疾病都是通过得以消灭。对于csfv而言，在病毒疫苗的研制过程 屮，由于csfv在组织培养细胞

7、屮的产量比较低，病毒囊膜脆弱，单位体积屮的 有效抗原含量较低，这样将csfv灭活后制成的灭活疫苗免疫效力比较低，因此, 长期以来，csfv弱毒株一直是常规疫苗生产屮实用而有效的疫苗来源。口前世 界上已经被广泛应用的良好猪瘟弱毒疫苗冇：我国培育的猪瘟兔化弱毒疫苗（c 株），法国的低温细胞弱毒疫苗thiverval株以及口木的低温细胞弱毒疫苗gpe- 株，这些疫苗的使用为防治猪瘟病毒起了十分重要的贡献。二.实验材料和方法【材料和试剂】pk-15细胞，由本室保存；c株疫苗购自中国兽药监察所；细胞培养用胎牛血清、细胞培养基（dulbecco's modified eagle's med

8、ium,dmem）月夷蛋白酶购于gibco brl公司；克隆所用的质粒pgem-t, x-gal, iptg ,rna提取试剂trizol,酚氯仿，异 丙醇购于promega公,pbluescript ii sk（+）购于stratagene公司;低拷贝质粒 pmc-18为p. mcminn傅士（澳大利亚悉尼医学院）惠赠；所用基因工程菌e.coli dh5a由木室保存；逆转录酶 superscript ii amv, dntp mixture 为 gibco brl 公司产品；pcr 高保真ex-taq和t4-dna连接酶为takara公司产品；所有限制性内切酶均为newengland bio

9、lab 产品；根据已经发表的猪瘟病毒c株和石门株序列设计csfv通用型引物，引物依 照从其所代表片段在全基因组中的位置來命名，引物序列和其所在基因组中的位 置列表如卜：f1: gtatacgaggttagttcattcr1: ctatctcatcggttgacgatf2: gcattcctcatctgcttgatr2: cccaatcttcacttccttaf3: actgcagtggtaacgagatgr3: ccatttctgtcaagtctgtf4: gtgacactatgggccggacr4: gtcacagtgtccattgtcf5: caaatgctatcaagacggagr5:

10、tcaccctgtagttccgtgaacf6: gagaactgagactcttggaggr6: ccagtcttgtttttgcttcagf7: acaatctgaaaaaaggtagr7: gcggccgcgggccgttagaaattacc引物在六合通和赛百胜公司合成，并用无菌超纯水溶解成100pmol/ml ,并 稀释为50分之一浓度放一20°c保存。实验方法1 病毒的扩增收集和分段cdna的获得：rna的提取：将10° tcid50ml的csfv感染pk-15细胞，24hr z后收集病毒以每 10cm2(35mm dish)加lmltrizol, 70°

11、;c将pk-15细胞反复冻融三次，取上清 ->12000g,离心10min(6°c)->取上清，室温放置5min->加200川氯仿，室温振 荡15s,室温放置2-3minl2000g,离心15min(6°c)取上清(约600 1)至 一个新管一>加500(11异丙醇，混匀，室温放置1 omin> 12000g, 10min(2-8°c)> 去上清,1ml 75%乙醇，涡旋t7500g, 5min(2-8°c)室温干燥5-10min(勿真空离 心)->rnase-free h2o 或 100% 甲酰胺(55-60&

12、#176;c)10min, -70°c 保存 mrnarna纯化(去除痕量dna)rna / h2o (depc)8010 x buffer100m dtt1rnase inhibitor4.5rql dnasel (rnase free)4.5total10037oc,30min-加入10川 终止buffer酚（depc水饱和）/氯仿抽提一2.5倍体积乙 醇，1/10体积naac, -70°c, l-2h70%乙醇洗涤-溶于甲酰胺屮备用rtpcrcdna合成oligodt2.8 (500|ig/ml)1rna1lomm dntp1ddh2o9total2065°

13、c, 5min冰浴2min离心后加入5 x first-strand buffer40mdtt2rnase out inhibitor(40units/|lil) 1 混匀t42°c, 2min加 lyl superscript ii rt70°c, 15min加 lyl e.coli rnaseh(2uni37°c, 20minpcr10 x buffer102.5mmdntp8primer l(20pm)1primer2(20|im)1taq pol0.5cdna20ddh2o59.5total100实验：rna - cdna - pcr2.完整连续cdna的

14、连接策略：将csfv c株的全长分为7个片断npro c e0 el e2 p7 ns2ns3ns4a ns4b ns5a ns5b02420 (spel)4166(pst i)23975712(hindiii) 7379(nhe i)56898676(pst i)7335sgrai( 10737)86511064912310图二.csfv c株分段克隆限制性酶切位点及内切酶名称将rt-pcr的产物分别连接到pgem-t easy载体上pcr产物冋收样品8teasy 载体 0.510x ligase buffer1t4 dna ligase0.510pl16°c水浴连接过夜，后转化e

15、.coli ,并筛选阳性克隆。进一步，用spe i和pst i消化teasy-(q2)和pbluescript sk什)载体，冋收酶切产物, 连接，得到sk-quan2t easy-quan2sk-quan2 进一步，用hind iii和pst i消化sk-(q2)和teasy-(q3),回收酶切产物得到sk-q2-q3sk-quan2hind iiisk-quan2-quan3进步，用 sal i 和 hind iii 消化 teasy-quan4 和 sk-quan2-quan3,回收酶切产物, 连接得到 sk-quan2-quan3-quan4quan 3(1824bp)sallsk-q

16、uan2-quan3sallsk(q2)(q3)(q4)用sac ii和spc i消化sk-(q2)-(q3)-(q4)和tcasy-quanl，并回收反应产物，连接，得到 sk-(q1)-(q2)-(q3)-(q4)tcasy-quan l(2495bp)sallsk(q2)(q3)(q4)sk-q1-q2-q3-q4用nhe i和pst i消化teasy-quan4和teasy-quan5,回收酶切产物并连接，得到 teasy-(q4)-(q5)quan 3(l824bp)teasy-quan5(l 341 bp)pmc18(q4)(q5)用pcr的方法将quan4-quan5 一起从te

17、asy-(q4)-(q5)合成出来并用hind iii和 psti消化载体和pcr产物，回收pcr产物，连接。pmc-18-(q4)-(q5)用 sac ii 和 sgrai 消化 teasy-quan6,teasy-quan7,回收反应产物连接，得到 teasy-(q6)-(q7)teasy-quan6(2086bp)tcasy-(q6)-(q7)使用pst i和not i消化teasy-(q6)-(q7)和pmc18-(q4)-(q5),并冋收酶切产物，连接得 到 pmcl 8-(q4)-(q5)-(q6)-(q7)sgraiteasy-(q6)-(q7)pmc-i8-(q4hq5)pmc

18、 18-(q4)-(q5)-(q6)-(q76621 bp最后,用 sac ii 和 bam hi 消化 pmc 18-(q4)-(q5)-(q6)-(q7)和 sk-(q1)(q2)(q3)(q4),回 收反应产物连接,得到 pmc 18-(q 1 )-(q2)-(q3)-(q4)-(q5)-(q6)-(q7)sk-qi-q2-q3-q4pmcl 8-(q4)-(q5)-(q6hq7bam h1csfvcstrain(12310bp)【实验结果】1. rt-pcr 结果:同时将17段得到：（其中q11q2,两段为后来的第一段q1）qi q2 q3 q4 q5 q6 q72. 连接结果：将 q

19、uanl 连接 sk-(q2)-(q3)-(q4)上得到 sk-(q1)-(q2)-(q3)-(q4)m 1注：用sac ii和spel鉴定，得至i2.4kb和10.2kb的目的片段。 将quan4.quan5连接到pmc18载体上,用pst i和hind iii酶切鉴定:amok将 pmc-18-(q4)-(q5)和 teasy-(q6)-(q7)连接在一起，用 pst i 和 hind iii 鉴定h. ok-j全长鉴定:3. uk_m 2345注：2:xba i消化全长连接产物，得到全长的线形化：5.2kb+12.3kb=17.5kb, 可以将连接结果和csfv石门株区分开来（后者有3个

20、切点）3: sal i+sac ii消化全长连接产物，得到5.2kb的载体片段和12.3kb的病 毒基因组cdna片段。4： sal i + not i消化全长连接产物，得到5.2kb的载体片段和12.3kb的 病毒基因组cdna片段。5： sall消化全长连接产物，得到全长的线形化：5.2kb+12.3kb=175kb北京人学政学者论文集（2003年） 全氏连接鉴定二:注：1：用sgra i + sac ii消化全长连接产物得到1.6kb和15.9kb的目的片段。2：用sal i + bam h i消化全长连接产物得到6.4kb和11.1kb的目的片段。将连接产物分别送到上海屮友生物技术公司

21、进行dna速列测定，得到测序图谱 和序列报告。【讨论】1.猪瘟病毒强毒株和弱毒株氨基酸序列的比较：选取三株强毒株（brescia,eystrup,石门）和三株弱毒株（cap,gpe,c株）进行 氨基酸序列的比较，找寻序列找寻强毒弱毒在氨基酸序列上的差异。a六株病毒整体比较结果100%95%b resicaeystmpshimengpe-capc99%98%98%98%97%由上面比较可知，bresica和eystrup这两株强毒株同源性比较高，而我室拥 有的国家标准强毒株石门株和另外两株强毒株的同源性略低一些。在弱毒株中，我室拥有的弱毒株c株和其他两株弱毒株的同源性比较低。b以基因组中基因顺序

22、为序比较c株和1996年moormann等发表的c株（chinese） 的同源性比较，两株的同源性为99.13%,而理论上这两株的氨基酸序列应该完全相同，这 种差异可能有两种原因:1. 次序过程中的误差。山于病毒的基因组比较长，所以在仪器测序和读谱过程中可能产 主。2. 由猪瘟病毒本身的变异导致。3山于我们测序使用的是疫苗用猪瘟病毒弱毒株，可能在对原始病毒进行处理时造成了 病毒基因组序列的变化。由于本实验得到的csfv c株全长cdna将作为f步实验的材料，我们希望通过实验 室现有的两株病毒对彫响猪瘟病毒毒性的因素进行分析，所以以下比较集中于对木室拥有的 石门株和c株进行比较。比较中的石门株序

23、列来自genebank no.af092448, c株序列为木 次实验结果。蛋白名称起止位点突变数目蛋白长度突变位点突变氨基酸 （c-ttl'j）突变率nprom1-c168816710k-r0. 047932s-f60k-n96a-v106d-n108v-t126r-k130t-1cs169-a267299202r-k0. 020408257a-tems(e0)glu268-ala49414227292n-s0.061947301g-e310h-y315v-t351h-y359p-l366d-n373v-a413a-v416v-i419s-g422i-n430t-i444a-te1l

24、cu495-gly68912195560nd0. 061856580p-s581h-y582d-e599t-r609c-w613e-k617i-v627e-k642v-a659i-t678v-ie2l690-a106019371704d-n0. 051351722n-s735s-i760k-g763p-l787r-g788s-f846d-e888v-q893r-k900d-n901g-e938t-a946i-v978m-r987t-a993r-k1019a-v1052v-ip7p1063-n11320690ns2k1133-g1589104561143g-e0. 021931199a-t124

25、8s-c1249h-y1320k-r1356m-i1372v-i1417v-a1455r-h1495r-kns3p1590-s2272126821606m-i0.0175951701v-a1716i-t1805s-n1942v-a1961d-e2042i-t2070p-s2158e-e2206k-r2248l-s2261t-ans4at2273-a23360630ns4bq2337-s268373462390a-k0. 0202312397i-m2418g-s2420i-t2468d-e2478a-v2679v-ins5as2684-s3180264962723d-n0. 0524192733

26、h-l2778r-k2788l-s2793a-v2795r-k2845h-n2911a-v2913g-v2930k-r2940l-p2959a-t2966s-a2977v-a2979a-t2984g-d2985l-p2987s-g3041s-n3065v-i3069r-k3089a-t3102n-d3114p-l3118m-t3129a-ens5bn3181-3898227173258v-i0.0306833277d-e3281r-g3301v-a3319s-g3341p-t3369g-e3436y-c3509e-k3510k-r3540r-m3561t-m3564s-t3570s-c3602

27、i-v3630f-l3720v-c3779f-l3817i-m3869t-a3879n-d3897a-v从上面结果，p7和ns4a比较保守，而ns5a,eo,e1,e2的差异率比较高达 到5%以上。其中eo,e1,e2为猪瘟病毒的囊膜糖蛋白，有文献表明e0在csfv 感染细胞z后将被大量分泌到感染细胞z外（rumenapf等，1993）,而但e0蛋 白可以诱导机体产生中和抗体，用e0免疫猪可以诱导产生对致死剂量病毒感染 的保护性免疫反应（rumenapf等，1991）,同吋e0也是病毒吸附进入易感细胞 的必要蛋片（konigm,1995）,在病毒粒子中，e0与e1或e2连接在病毒粒子的 表面（

28、rumenapf等，1993）。同时，e0还具有核酸酶活性,± hulst等的实验结 果，对c株全长cdna的e0基因屮的2个h残基（297和346位）进行突变（变 为k）,得到了无核酸酶活性的病毒突变体，该突变体可以引起诉诸细胞的病变 效应。说明e0上的氨基酸对于维持核酸酶活性及构彖有十分重要的作用，所以， 可以尝试对于上面列出的一些强毒株和弱毒株不同的氨基酸位点进行点突变，也 许可以找到更多类似的位点，可进一步澄清强毒株和弱毒株和细胞之间关系上的 弟异。同时，由于e0蛋白可以引起保护性免疫反应，可以推测强毒株和弱毒株 在引起保护性免疫反应的能力上应该存在差异，从这一点入手，比较强

29、毒和弱毒 的差异可以对疫苗的研制起提示作用。e2是csfv的主要保护性抗原蛋白，能诱导机体产生中和抗体（rumenapf 等，1993； greiser-wilke等1990）。同样可以推测，是由于强毒和弱毒在e2蛋 白的一级结构和以它为基础的高级结构上存在差异，导致不同毒株的该蛋白稳定 性或水溶性等方面的性质存在差异，导致它们在引起不同的感染后结果。由于对 于e2抗原的结构已经有一定的了解（van rijin等，1994）,所以可以集屮对e2 上的单个抗原结构单位进行突变或构建重组蛋白，研究与病毒病毒感染引起的免 疫反应过程。对于ns5a的己知信息比较有限，仅仅了解它是rna聚合酶ns5b的

30、辅助 因子，由于在这个区域存在的比较明显的强弱毒株之间的差异，同吋由于ns5b 区域中的差异率也不是很低，推测，强弱毒株在其病毒rna聚合酶活性上也存 在差异，导致不同的感染后结果。另一方面，可以看到有一些蛋口比较保守，p7,ns3,ns4a,其中，p7和ns4a 由于木身比较短，所以可能不是很有代表性，但十分明显，ns3是-个比较保守 的蛋众多文献已经证明，它是在病毒多聚蛋白的加工中起重要作用的蛋白酶， 涉及病毒生命活动的最重要环节，所以在强弱毒株中没有明显区别，所以在ns3 区域产生的差异可能只是捉示我们这些位点对丁病毒的生命活动没冇明显的影 响，在研究ns3的作用时无需在那些位点设计点突

31、变。总之，从当前对于猪瘟研究的趋势來看，弱毒株是比较有价值的研究材料， 所以，在本次实验后，我们可以设计一系列的实验，以探询强弱毒株z间的差异 位大的指导方向，做许多有意义的工作。【附录】csfv c株全长测序结果:102030405060gtatacgaggttagtt cat tctc gt at a cacgattg gacaaatcaaaattataat ttggt708090100110120tcagggcctccctccagcgacggccgaactgggctagccatgcccatagtaggactagca130140150igo170180aaacggagggactagccat

32、agtggcgagctccctgggtggtctaagtcctgagtacagga190200210220230240cagtcgtcagtagttcgacgtgagcagaagcccacctcgagatgctacgtggacgagggc250260270280290300atg cc caagacacacc ttaac cc tagcgggggtcg ctagggtgaaatcacac cac gtgat310320330340350360gggagtacgacctgatagggcgctgcggaggcccactattaggctagtataaaaatctct37038039040041042

33、0gctgtacat ggcacat ggagttgaatca ct ttgaa ct tttatacaaaacaaacjkaacaaamelnhfellyktnkq4304404504 60470480aaccaatgggagtggaggaaccggtgtacgatgccacggggagaccattgtccggagacc kpmgveepvydatgrplsgd49050051052053054 0cgagt gaggtacac ccacaat caacactgaag ct a ccacat gataggggtagaggcaaca psevhpqstlklphdrgrgn5505605705

34、80590600ttaaaacaacactgaagaacctacctaggaaaggcgactgcaggagcggcaatcatctagi kttlkn 匸 prkgdcrsgnh 匸610620630640650660gcccggtcagtgggatatatgtaaaacccggccctgtcttttaccaggactacatgggcc gpvsgiyvkpgpvfyqdymg670680690700710720cgg cc ta ccatagagc ccct ctggagtttt ttgacgaagtgcagtt ct gcgaggt ga cca payhrapleffdevqfcevt

35、730740750760770780aaaggataggtagggtgacaggtagcgacggaaggctttaccatacatatgtgtgcatcg krigrvtgsdgrlyhtyvci79080081082083084 0atggc tg catac tg ct gaagctggc caagaggggtgagc caagaac cc tgaagtggatta d g c i llklakrgeprtlkwi850860870880890900gaaatttcaccgactgtccattgtgggttaccagttgctccgatgatggcgcaagtggga rnftdcplw

36、vtscsddgasg910920930940950960gtaaagagaagaagccagataggatcaacaaaggcaaattaaaaatagcccc/kjkaagagc skekkpdrinkgklkiapke970980990100010101020atgagaaggacagcagaactaggccacctgacgctacgatcgtggtggaaggagtaaaat hekdsrtrppdativvegvk103010401050106010701080accaggtcaaaaagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgtaccacayq

37、vkkkgkvkgkntqdglyh109011001110112011301140acaagaataaac caccagaat ccaggaagaaattagaaaaagcc ctat tggcatggg cgg nknkppesrkklekallawa115011601170118011901200tgatagcaattatgtt gtac caac c agttgaagc cgaaaat ataactc aat ggaac ctgaviaimlyqpveaenitqwnl121012201230124012501260gtgacaacggcactaatggtatccagcatgcgatg

38、taccttagaggggttaacagaagct sdngtngiqhamylrgvnr s127012801290130013101320tgcatgggatctggccggggaaaatatg caaaggagtcccaacccacctggccacagacg lhgiwpgkickgvpthlatd133013401350136013701380tggagctgaaagaaatacagggaatgatggatgccagcgaggggacaaactatacgtgct velkeiqgmmdasegtnytc139014001410142014301440gtaagttacagagacatg

39、aatggaacaaacatggatggtgtaactggcacaatatagacccklqrhewnkhgwcnwhn i d145014601470148014901500cctg gatacagc cgat gaatagaac ccaagcagactt gg ca gaagg cc ctc cggt caagg pwiqpmnrtqadlaegppvk151015201530154015501560agtgcgctgtgacttgcaggtacgataaagatgctgacatcaacgtggtcacccaggctae cavtcrydkdad i n v v t q a15701580

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