DNA的分离、提取和纯化技术-WLPPT精品文档

1、1DNADNA的分离、提取和纯化的分离、提取和纯化技术技术 营养与食品卫生学专业营养与食品卫生学专业王王亮亮23DNADNA的理化性质及特点的理化性质及特点一一 物理性质物理性质 1 1、形态、形态 DNADNA为白色纤维状固体（通常溶于为白色纤维状固体（通常溶于TETE缓冲液或水）。缓冲液或水）。2 2、溶解性、溶解性 溶于水溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；DNADNA在水中呈粘性胶体溶液。在酸性溶液中在水中呈粘性胶体溶液。在酸性溶液中DNADNA易水解，易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。在中性或弱碱性溶液中较稳定。4 核酸既含有酸

2、性的基团，又含有弱碱性的基团，故可核酸既含有酸性的基团，又含有弱碱性的基团，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的发生两性解离。其解离状态随溶液的pHpH值而改变。值而改变。3 3、两性解离、两性解离 利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。5 嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在紫嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在紫外区外区260nm260nm和和280nm280nm处有强的吸收峰处有强的吸收峰 。在。在260nm260nm紫外线下，紫外线下，1OD

3、1OD（光密度值）相当于双链（光密度值）相当于双链DNADNA浓度为浓度为5050g/mlg/ml；单链；单链DNADNA为为4040g/mlg/ml。因此可根据核酸溶液的。因此可根据核酸溶液的ODOD值，值，计算核酸样品的计算核酸样品的浓度或含量浓度或含量。对于纯的。对于纯的DNADNA，可以通过，可以通过A260/ A280A260/ A280值来判断值来判断其其纯度纯度。纯的纯的DNADNA：A260/ A280 =1.8A260/ A280 =1.8 二二 紫外吸收性质紫外吸收性质 6DNADNA的特点的特点（1 1）DNADNA（或（或RNARNA）是水溶性的。）是水溶性的。（2 2

4、）嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系）嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系 （3 3）从核酸的分子结构上看，核酸是两性电离，既带正电荷，）从核酸的分子结构上看，核酸是两性电离，既带正电荷， 又带负电荷。又带负电荷。（4 4）DNADNA在细胞中存在部位不同（细胞核、线粒体、质粒）。在细胞中存在部位不同（细胞核、线粒体、质粒）。（5 5）DNADNA空间构象不同，电泳时迁移率不同。空间构象不同，电泳时迁移率不同。 （6 6）根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针。）根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针。（7 7）DNADNA的双螺旋结构。的双螺旋结构。7 DNADNA提取的方案提取的方案

5、：应根据具体生物材料和待提取的核酸分：应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及子的特点而定。不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，基因组所含的成分不同，基因组DNADNA的提取方法也有差异。的提取方法也有差异。 在提取某种特殊组织的在提取某种特殊组织的DNADNA时必须参照文献和经验建立相应时必须参照文献和经验建立相应的提取方法的提取方法, , 以获得可用的以获得可用的DNADNA大分子。大分子。 DNADNA的提取方案的提取方案 8DNADNA提取、纯化的方法提取、纯化的方法（1 1）酚抽提法）酚抽提法（2 2）甲酰胺解聚

6、法）甲酰胺解聚法（3 3）玻璃棒缠绕法）玻璃棒缠绕法（4 4）异丙醇沉淀法）异丙醇沉淀法（5 5）以及适用于小样品量）以及适用于小样品量DNADNA提取的试剂盒等提取的试剂盒等 大多数核酸提取与纯化的方法包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。不同的方法之间主要是步骤与技术的差异，原理基本一致。最经典的最经典的最常用最常用9 试剂盒提取DNA实验原理：实验原理： 试剂盒提取试剂盒提取DNADNA的基本原理是用细胞裂解液的基本原理是用细胞裂解液CLCL、缓冲液缓冲液FGFG和蛋白酶和蛋白酶K K，破坏、消化细胞，用异丙醇和，破坏、消化细胞，用异丙醇和乙醇沉淀

7、乙醇沉淀DNADNA，最后收获，最后收获DNADNA。 10试剂盒提取试剂盒提取DNADNA的基本步骤的基本步骤细胞破碎、裂解细胞细胞破碎、裂解细胞核酸与其他大分子物质分离核酸与其他大分子物质分离核酸纯化核酸纯化酶处理酶处理11所用器械与设备所用器械与设备121.1.磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBSPBS）：）：用于漂洗样本用于漂洗样本2.2.细胞裂解液细胞裂解液CLCL：裂解细胞、破坏细胞裂解细胞、破坏细胞 3.3.蛋白酶蛋白酶K K与缓冲液与缓冲液FGFG：消化细胞、缓冲溶液消化细胞、缓冲溶液pHpH值、抑制值、抑制DNADNA聚聚 合酶活性、破坏降解合酶活性、破坏降解RNARNA4.4

8、.异丙醇：异丙醇：沉淀沉淀DNADNA5.70%5.70%乙醇：乙醇：漂洗漂洗DNADNA6.6.缓冲液缓冲液TETE：溶解溶解DNADNA试剂及其作用试剂及其作用13样品前处理样品前处理(1)(1)从低温冰箱中取出事先采集好的血样从低温冰箱中取出事先采集好的血样(2)(2)将血细胞放入研磨器中研磨。将血细胞放入研磨器中研磨。(3)(3)加入加入PBSPBS缓冲液，将样本转移缓冲液，将样本转移13ml13ml离心管中，离心管中，5400rpm5400rpm， 20min20min，4 4度离心，弃上清。度离心，弃上清。(4)(4)用用1mlPBS1mlPBS将离心沉淀物转移至将离心沉淀物转移至

9、1.5mlEP1.5mlEP管中，管中，5400rpm5400rpm，3min3min，4 4度离心，弃上清。度离心，弃上清。14（1 1）若不能马上进行）若不能马上进行DNADNA提取，可将样本封存贮存于提取，可将样本封存贮存于2020冰箱冰箱 中。中。（2 2）研磨均匀，没有团块）研磨均匀，没有团块（3 3）离心时注意配平）离心时注意配平注意事项注意事项15 DNA DNA提取步骤提取步骤 1 1消化消化 向上述处理好的样品溶液中，加入细胞裂解液向上述处理好的样品溶液中，加入细胞裂解液CLCL，颠倒混匀数次（目的：细胞破裂，使蛋白、核，颠倒混匀数次（目的：细胞破裂，使蛋白、核酸释放）。酸释

10、放）。12000rpm12000rpm，1min1min，弃上清。将离心管倒，弃上清。将离心管倒置在吸水纸上。置在吸水纸上。16 2 2缓冲液缓冲液FGFG与蛋白酶与蛋白酶K K 向样品中加入缓冲液向样品中加入缓冲液FGFG与蛋白酶与蛋白酶K K的混合液，的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块，混匀非常重要，充分立即涡旋混匀至溶液无团块，混匀非常重要，充分的混匀有利于将蛋白质等大分子物质与蛋白酶的混匀有利于将蛋白质等大分子物质与蛋白酶K K接接触。触。17 3 3水浴水浴 6565度水浴度水浴10min10min，其间颠倒数次。，其间颠倒数次。 4 4加入异丙醇加入异丙醇 颠倒充分混匀至出现丝状或

11、簇状颠倒充分混匀至出现丝状或簇状DNADNA。 12000rpm12000rpm，5min5min，弃上清。倒置在吸水纸上。，弃上清。倒置在吸水纸上。 5 5加入加入70%70%乙醇，涡旋振荡乙醇，涡旋振荡5 5秒钟，秒钟，12000rpm12000rpm，2min2min， 弃上清。重复操作两次。倒置在吸水纸上，至少弃上清。重复操作两次。倒置在吸水纸上，至少5min5min。空气干燥空气干燥DNADNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5min5min）6. 6. 加入缓冲液加入缓冲液TETE，低速涡旋，低速涡旋5s5s，6565度加热度加热10min-1h10

12、min-1h， 溶解溶解DNADNA，其间弹数次助溶，其间弹数次助溶18残液大分子物质混合液混合液细胞裂解液细胞裂解液CLCL混合液离心、弃上清离心、弃上清缓冲液缓冲液FGFG与蛋白酶与蛋白酶K K沉淀生成异丙醇异丙醇DNA70%70%乙醇乙醇缓冲液缓冲液TETE19 7. 7.样品测定样品测定 在在260nm260nm紫外线下：紫外线下： 1OD 1OD5050g/mlg/ml（双链（双链DNADNA） 1OD1OD4040g/mlg/ml（单链（单链DNADNA或或RNARNA） 根据根据A260/A280A260/A280比值，可判断所提取核酸（比值，可判断所提取核酸（DNADNA）的）

13、的纯度纯度:DNA:DNA纯度比较理想的比值是纯度比较理想的比值是1.81.8。 提取的提取的DNADNA溶液的溶液的A260/A280A260/A280比值高于比值高于1.81.8，说明有，说明有RNARNA的污染；低于的污染；低于1.81.8或或1.751.75，则认为是蛋白质或酚污染。，则认为是蛋白质或酚污染。 20 本方法的注意事项：本方法的注意事项： 1 1）缓冲液）缓冲液FGFG与蛋白酶与蛋白酶K K现用现配，加入到样本以现用现配，加入到样本以 后立即涡旋后立即涡旋 2 2）乙醇的残留会影响后续的反应（酶切、）乙醇的残留会影响后续的反应（酶切、PCRPCR等）等） 3 3）过分干燥

14、）过分干燥DNADNA沉淀会影响沉淀会影响DNADNA的溶解的溶解21核酸提取的原则核酸提取的原则: :1.1.保证核酸一级结构的完整性。保证核酸一级结构的完整性。2.2.排除其他分子的污染，即纯度要高。排除其他分子的污染，即纯度要高。核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求：1.1.核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；浓度的金属离子；2.2.其它生物大分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；3.3.排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。核酸制备的一般原则核酸制备的一般原则22注意

15、事项注意事项 1. 1.尽量简化操作步骤，缩短提取过程。尽量简化操作步骤，缩短提取过程。2.2.减少化学因素对核酸的降解。减少化学因素对核酸的降解。3.3.减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温和高温4.4.防止核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。 23DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质DNADNA在溶解前，有在溶解前，有酒精残留，酒精抑酒精残留，酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应DNADNA中残留有金属中残留有金属离子离子重新纯化重新纯化DNADNA，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质重新沉淀重新沉

16、淀DNADNA，让，让酒精充分挥发酒精充分挥发增加增加7070乙醇洗涤乙醇洗涤的次数（的次数（2-32-3次）次）q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原 因因 对对 策策24材料不新鲜或反复材料不新鲜或反复冻融冻融未很好抑制内源核未很好抑制内源核酸酶的活性酸酶的活性提取过程操作过于提取过程操作过于剧烈，剧烈，DNADNA被机械被机械打断打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染反复冻融反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的在提取内源核酸酶含量丰富的材料的材料的DNADNA时，可增加裂解时，可增加裂解液中螯合剂的含量液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌经高温灭菌将将DNADNA分装保存于缓冲液中分装保存于缓冲液中，避免反复冻融，避免反复冻融q问题二：问题二：DNADNA降解降解原原 因因 对对 策策25实验材料不佳或量实验材料不佳或量少少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗涤时洗涤时DNADNA丢