板栗多酚氧化酶酶学性质研究

1、板栗多酚氧化酶酶学性质研究指导老师：鲁周民赵君，徐丽，曾奇(西北农林科技大学林学院，陕西杨凌)摘要：以邻苯二酚为底物，在420nm的波氏处采用分光光度法研究了秦岭南北 过渡区板栗屮多酚氧化酶(ppo)的酶学性质，探讨了抗坏血酸、柠檬酸、四硼 酸钠、edta2na、亚硫酸氢钠、氯化钠、氯化钙、硫腺、疏基乙醇以及铜试剂 十种抑制剂对板栗酶促褐变的抑制效杲。结杲表明：板栗多酚氧化酶最适ph5.4； 最适温度为45°c, 60°c以上使酶迅速失活；最大反应速度vmax=40.82u,米氏常数km=0.036rnol/1；十种抑制物质对该酶均表现岀不同的抑制作用，抑制效果最 强的抑制

2、剂为抗坏血酸、亚硫酸氢钠以及筑基乙醇。关键词：南北过渡区；板栗；多酚氧化酶；酶学性质；抑制剂板栗(castanea mollissima blume)属山羊樺科栗树木木粮食树种，栽培历 史十分悠久，素冇“铁杆庄稼” z称，它营养丰富，风味独特。新鲜板栗含水 分50%、蛋白质4.0%4.5%、脂肪0.7%0.8%、碳水化合物40%42%、纤维素 1.6%1.8%,此外还富含va、vb、vc和ca、p、k、fe等矿物质丽。板栗淀粉 中支链淀粉含量较高，粉质细腻，香糯可口，风味极佳，因此深受消费者喜爱。 但由于板栗屈顽拗性种了，采后极易褐变和衰老，因此，板栗在加工中影响产 品质量的主耍技术难题是褐变

3、，冇关板栗屮多酚氧化酶性质的研究却报道极少。 本文就板栗在加工过程中产生褐变的问题，针对多酚氧化酶的性质进行了研究, 有助于进一步弄清板栗在加工过程屮产生褐变的原因。多酚氧化酶(polyphenol oxidase,ppo)又称儿茶酚氧化酶、酪氨酸酶、苯酚 酶、甲酚酶、邻苯二酚氧化还原酶。它是一类广泛存在于植物体内的能催化多 酚类氧化成醍类的含铜质体金屈酶卩四，是引起水果、蔬菜发生酶促褐变的主要 酶类山"，从而导致水果、蔬菜的褐变和营养损失-严重损害食品的感官质量, 并会降低植物的经济价值。因此，在食品科学领域特别重视对它的研究口习。近 年來人们从生物学本身多方位地对ppo开展了研究

4、，但至今ppo的生理功能还 是一个谜，为进一步探究多酚氧化酶的生理特性，木文以秦岭南北过渡区的 板栗为研究对象，探究了板栗多酚氧化酶的酶学性质以及多种抑制剂对酶促褐变 的抑制效果。1材料与仪器1.1材料供试板栗为镇安县板栗研究所购得的成熟、未受机械损伤、新鲜的板栗。na2hpo4 12h2o； nah2po4 - 2h2o；聚乙烯毗咯烷酮;固体硫酸鞍; 邻苯二酚、抗坏血酸、柠檬酸、四硼酸钠、edta2na、亚硫酸氢钠、氯化钠、 氯化钙、硫服、疏基乙醇以及铜试剂均为分析纯。1.2仪器jj2组织捣碎匀浆机（金坛市富华仪器有限公司）；avanti j-25告诉冷冻离 心机（美国贝克曼公司）；hh-2

5、数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器冇限公司）； uv-7502pcs紫外可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；ta51001电了天 平（上海精科天平）；bcd-233ch星星冰柜（北京星星冰柜冇限公司）。2实验方法2.1板栗ppo酶液的制备参照giovanni spagna1141好josefa escribano115,161的方法并加以改进：称取板 栗中间部分200g,加入预冷的0.2mol/l ph6.5的na? hpc-nah? po。缓冲液（4 °c,简称 pbs）（含 o.lmol/lvc 和 0.5%聚乙烯比咯烷酮（pvp）各 10ml）300ml, 用高速组织捣碎机捣碎

6、成匀浆，转移至烧杯屮，用100ml缓冲液分4次淋洗打浆 杯，并全部转移至烧杯中。取86个离心管，将烧杯中匀浆全部转移至10ml离心管中。分别用50ml 缓冲液淋洗烧杯，将浆液全部转入离心管中；在4°c,以7500r/min离心lomin,弃沉淀,取其上清液,作为ppo的粗提 液。量取粗捉液体积（380ml）,向粗捉液中边搅拌边加入固体硫酸讓（85.88g） 至40%饱和度（每100ml溶液中加22.6g固体硫酸钱）；取54个离心管，装入粗提液，4°c下，以7500r/min离心15min,弃沉淀， 取其上清液。量取体积并记录后，继续加硫酸鞍达80%饱和度（每looml溶液

7、中加25.8g固体硫酸镀）；在4°c条件下静置lh,取54个离心管,再以4°c, 7500r/min离心15min, 弃去上清液，所得沉淀用400ml 0.2mol/lph6.5磷酸缓冲液溶解。用0.2mol/l ph6.5磷酸缓冲液透析6h （每隔lh更换一次透析液）。透析后 的溶液即为部分纯化的ppoo放入棕色瓶中于4°c下冷藏备用。2.2板栗ppo最适波长的确定在lcm比色皿屮，加入0.2mol/lph6.5的pbs配制0.2mol/l的邻苯二酚溶 液3.5ml ,及0.5ml的ppo提取液，室温下迅速混合均匀,然后再波氏360450nm 间测定吸光度a的变

8、化。每隔30s记录1次吸光值a,共记录11次，重复测三 次。见图1。2.3板栗ppo活力的测定i分别将0.2mol/l ph6.5的pbs配制0.2mol/l的邻苯二酚溶液3ml和酶液 lml于45°c下保温5min,迅速混合，摇匀，于波氏420nm处比色测定。从酶液 加入后开始计吋，每30s记录一次吸光度od,以最初直线段的斜率（ od/at） 计算酶活力。一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.001所需的酶量阴。酶的比活性按下式计算：酶的比活性(u/g) =aod d/ (0.001 fw t)式中,aod为反应时间 内光密度的变化；fw为样品鲜重(g)；

9、t为反应时间(min)； d为稀释倍数， 即提取的总酶液为反应系统内酶液体积的倍数。2.4多酚氧化酶活力影响因素2.4.1温度对ppo活力的影响 在lcm比色jiti中，加入0.2mol/l ph6.5的pbs 配制 0.2mol/l 的邻苯二酚溶液 3.5ml ,分别在 12.5, 20, 30, 32.5, 35, 37.5, 40, 42.5, 45, 47.5, 50, 52.5, 55, 57.5, 60, 70, 80, 90°c条件下保温 5min, 加入相同温度下保温5min的ppo粗酶液0.5ml,测其吸光度值。以ppo酶活为 纵坐标，以温度为横坐标，绘制曲线。结果

10、见图2。2.4.2 ph对ppo活力的影响配制不同缓冲液，使反应体系的ph值分别为2.4、3.4、4.4、5.4、6.5、7.5、8.6、9.6。反应体系包括 0.2mol/l ph6.5 的 pbs 配制0.2mol/l的邻苯二酚溶液3.5ml, ppo粗酶液0.5ml, 45°c保温5min,测其 ppo酶活。结果见图3。2.4.3底物浓度对板栗ppo活性的影响 使用0.2mol/l ph6.5的pbs分别配 制0、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1mol/l邻苯二酚溶液,40°c下分别加入相同 温度下保温5min的ppo粗酶液0.5ml,测其吸光度值。

11、以ppo酶活为纵坐标， 以温度为横处标，绘制曲线。研究底物浓度对ppo活性的影响。结果见图4。2.4.4齐种抑制剂对板栗ppo活力的影响 在lcm比色1111中，加入0.2mol/l ph6.5的pbs配制0.2mol/l的邻苯二酚溶液3.5ml ,分别加入不同百分含量的 抑制剂在45°c条件下保温5min,然后加入相同温度下保温5min的ppo粗酶液 0.5ml,测其吸光度值。蒸谓水为空白。结果见图6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15o图中的相对100%活力定义为：板栗多酚氧化酶没冇加入任何抑制剂， 而是以相同体积的蒸镉水代替抑制剂后测得的数值为多酚氧化酶的100%

12、相对活 力。3结果与分析3.1最适波长的确定0360370380390400410420430440450波长(nm)体系反应产物在可见光波360450nm下吸光度的变化如图1所示。8 6 4 2 o o o o(<)图1板栗ppo最大吸收波长的确定曲图1可知，在可见波长420nm处冇最人吸收峰。而且在波长360420nm 范围内随着波t的增加吸光度a值逐渐增加；在波t 420450mn范围内随着波 长的增加吸光度a值逐渐降低，因此选择420nm为工作波长，测定数据a420nm 力7 o3.2温度对ppo活性的影响温度对酶促反应的影响通常包括两个方而：一方而是当温度升高时反应速度 加快；

13、另一方面，随着温度升高而使酶蛋口逐渐变性，反应速度随之下降。 因为多酚氧化酶是蛋白质，不适宜的温度会破坏活性部位三维结构的完整性和稳 定性，从而使ppo失活。因此温度是保持酶活力的关键。分别在不同温度测定 酶的活性，结果如图1所示。温度ppo 性温度(u)80604020o担炉友sodd2温度对ppo活性的影响由图2可看出，当温度降至12.5°c时,酶活性仅为最高活性的8%；在12.545 °c的范围内随着温度上升，酶活性逐渐增强；在45°c吋ppo活性最强；当温度 大于45°c时，随着温度的上升，ppo的活性逐步减弱；当温度升至60°c时，酶

14、 活性仅为最高活性的29%；当温度高于70°c时，酶活性更是降为最高活性的8% 左右，可近似地认为酶已没有活性，80、90°c时反应体系处理5min,该酶全部 失活，同时观察到大量沉淀的出现。所以在以后的试验中我们采用45°c作为酶 的反应最适温度。曲图2可以看出，板栗ppo活性随温度的变化呈一定的双峰现象，说明板 栗ppo可能有同工酶存在，需要进一步研究。3.3 ph对ppo活性的影响酶是一种生物活性物质，调节ph值能有效地改变酶的活性l20'21jo ppo是 一种含铜蛋白质，其作用机制在于铜的氧化还原作用，在ph改变的条件下构象 会发生变化，从而影响

15、其活性。在ph较低的酸性环境条件下，ppo中的辅基 cf+被解离出來，使酶失活；在ph大于7的碱性环境条件下，ppo中的辅基c严会解离生成不溶性的cu (oh) 2,也会使酶失活，从而减少酶促褐变发生。 其结果如图2所示。(96)tlkodd2000806040200phppo活性3.44.45.46.57.58.69.6ph图3 ph对ppo的影响由图3可知，在ph为5.4时ppo活性出现一个最高峰，为板栗ppo的最 适ph值，当ph为2.4吋，酶活性仅为最高活性的32.1%；当ph大于5.4吋ppo 的活性随ph的变化反应较为敏感，随ph值升高ppo活性迅速降低，至ph为 9.6时酶活性几

16、乎丧失。同时，由图2可见在ph为4.4时有一个肩峰出现，可能 是同工酶产生的影响。而很多研究表明，在一些植物屮均发现有ppo同工酶的 存在，已有文献报道了板栗山中的多酚氧化酶具冇同工酶。由此可见，不同的ph值对ppo活性影响较大。因此，在加工生产板栗产品、 板栗保鲜及贮运过程屮，可以根据这一性质考虑采取适宜措施来调整ph值，抑 制ppo的活性，从而用來抑制板栗的褐变。3.4底物浓度对板栗ppo活性的影响底物浓度对酶活力的影响如图4所示。30(upn v)超oh252015105000.010.0250.050.0750.1底物浓度(mol/l)图4底物浓度对ppo的影响当底物浓度小于0.075

17、mol/l时，随着底物浓度增加，酶活力也相应的增加， 即反应速度也相应的增加；反应速度与底物浓度基木呈线性关系；当底物浓度大 j 0.075mol/l时反应速度随着底物浓度的增加曲线走向趋于平缓，酶活力变化很 小，最后趋于极限值。说明该酶促反应存在一个适宜的邻苯二酚用量，当底物浓度达到这一适宜值 时，在増加底物浓度对酶的活性作用不人。这是因为底物浓度较低时，冇一些酶 的活性部位与底物相结合，使酶促反应进行，在达到一定浓度后，进一步提高底 物浓度也不能提高酶活性，酶活性达到最大值，这可能是ppo有效活性被结合 完后产生的抑制效应的结果【224】。以邻苯二酚为底物，根据中间符合学说，催化反应可表示

18、为： e+sesp+eo因为v唤是在极大的底物浓度下获得的，它不可能从双曲线图 测得（kj也是如此）1241 o因此根据实验数据用lineweaver-burk作图法，以右为 纵坐标，以丄为横坐标，将米氏方程v二上1转化为丄=“.丄+ 丄形skm + s v vux s vmax式，作出in。对1/的双倒数图，根据图线求出kg和v唤，进而推导岀相应 的米氏方程宙。对实验结果进行处理做岀1/v °1/s图。0.15 斤一0204060801001201/s (l/mol)图5米氏常数米氏常数的物理意义是酶反应达到最大反应速度一半时的底物浓度。它与酶 的性质有关，有酶的浓度有关，不同酶各

19、有特定的km值，其k,n值最小的底 物一般称为该酶的最适底物，km值的倒数可近似表示酶对底物亲和力的大小， 倒数值越大，底物与酶的亲和力越大。当v=1/2v的特噺殊情况，发现km=s，也就是说kg是达到最大反应速度一半时的底物浓度。kg值越小，说 明达到最大反应速度一半吋所需底物浓度就越少，酶对底物的亲和力就越大，反 之亦然。从图5中可以得出，拟合直线的相关系数达到0.9950，可见ppo酶促褐变 反应动力学符合米氏方程。根据直线斜率和纵轴截距，可以得到方程：y=0.000887x+0.0245可求得该反应的米氏常数km=0.036mol/1,最大反应速率vniax=40.82u/mino表明

20、板栗ppo对邻苯二酚有很好的亲和力。在一定温度、ph和酶液浓度条件下, 酶催化反应的初始阶段与邻苯二酚底物浓度成正比门叫3.5不同抑制剂对板栗ppo的影响3.5抗坏血酸对ppo的影响抗坏血酸对板栗ppo活性的影响如图6所示。000.060.10.30.60.81vc (%)200080o o o6 4 2图6 vc对ppo影响由图6可知，抗坏血酸对ppo表现出明显的抑制作用，不同浓度的vc随 ppo的活性冇不同的抑制作用，并且随着抗坏血酸的浓度增加，ppo活性明显 下降，吸光度值与抗坏血酸的浓度呈负相关，其抑制率不断升高。由丁抗坏血酸可作为酶分子屮铜离子的螯合剂，抑制酶促褐变反应的发生, 另外

21、过多的抗坏血酸可作为铜的还原剂，将体系中原有的酮类还原为无色物质, 使其具有抗氧化和抑制褐变的作用27。抗坏血酸在多酚氧化酶的反应屮对褐变 抑制的主要机制为17'281：邻苯二酚+1/2氧气-邻本二酿+水，邻本二酿+抗坏血 酸邻二酸+脱氢抗坏血酸，从而抑制了醞进一步聚合成黑色素。因此在板栗加 工处理屮，可以通过添加这些酶抑制剂来减轻或防止褐变的发生，但抗坏血酸使 用过程中会被氧化消耗而逐渐减少，而且这一变化乂能加重非酶促褐变，生产上 使用也会加大成木。3.5.2柠檬酸对ppo活性的影响柠檬酸抑制板栗中的ppo活性，控制其褐变的机理主要有两个方面：一是 因为板栗屮的ppo是以铜作为辅基的

22、金屈蛋白绚，柠檬酸中的三个竣基对ppo 中的铜起较强的螯合作用，达到一致其活性的目的。而是柠檬酸对反应体系的 ph有调节作用，使甘薯屮的ppo远离其最适作用范围而降低活性。1201008060402000.22.550.51柠檬酸（%）图7柠棣酸对ppo的影响如图7所示，随着柠檬酸的增加，柠檬酸的抑制作用逐渐增加，柠檬酸在低 浓度时对酶活力的抑制作用不明显，但高浓度的柠檬酸才有一定的抗褐变效果。 当其浓度达到lmol/1,可以使ppo得相对活性降低到53.3% ;当浓度为2.5mol/l 吋,ppo的相对活性降到4.6% ;当浓度为5mol/l吋,ppo的相对活性仅为0.9%, 几乎无活性，即

23、当反应液柠檬酸浓度为0.255mol/l时可冇效地抑制褐变。说明柠 檬酸对ppo有一定的抑制作用，但用量显然高于抗坏血酸。原因可能是低浓度的柠檬酸对体系ph影响冇限，且较少的用量不能络合 足够的铜辅基。而高浓度的柠檬酸可使体系ph降低，使之远离最适ph值而降 低活性，同吋还可络合铜辅基而达到一致多酚氧化酶活性。因此单独使用柠檬酸 并不理想】，于新等人认为柠檬酸与亚硫酸氢钠同吋使用能大大增强抑制褐变 的效果卩°】。3.5.3亚硫酸氢钠对ppo的影响nahsos是防止果蔬酶促褐变常用的物质，抑制褐变主要通过nahsos提供 的so?对酶促褐变抑制很大程度上是rtr丁其与中间产物邻酿加成反

24、应的结果， nahsos对反应体系的抑制作用较复杂。一方而，亚硫酸氢钠抑通过不可逆的与 酿生成无色的加成产物，与此同时降低了酶作用于一元酚和二疑基酚的活力- 另一方面，还有漂白和防止微生物污染的作用。(次) 112010080604020000.060.10.30.60.81亚硫酸氢钠（）图8亚硫酸氢钠对ppo的影响图8表明，nahsos为多酚氧化酶的强抑制剂，随着nahsos反应体系中质量分数的增加，酶活性显著下降，当亚硫酸氢钠的浓度为0.1%时，就可以使多 酚氧化酶的相对活力降低到仅为对照的1/3左右；在0.31%浓度范围内，酶活 力的变化趋势不十分显著，基木上呈一水平线，其屮亚硫酸氢钠浓

25、度的不断增加, 抑制效果越來越好，当其浓度达到1%时，板栗多酚氧化酶的相对活力降低到20 %以下。因此，可以看岀，用亚硫酸盐溶液处理随抑制褐变的效果很显著，其至优于 抗坏血酸溶液处理。因此这两种抑制剂均有极强的抑制作用，这与文献报道的基 本相同（孔繁东等,2000：毕阳和欧阳春光,2001；林伯年等,1997）o根据村 田木间卩2】的分类，nahsos、vc分属不同类型的ppo抑制剂，nahso3和vc对ppo活性的抑制作用是将酶促褐变反应的屮间产物叫述原而抑制褐变，但vc 容易发生的营养成分，安全性高。nahso3具有较高的护色作用，也常用作ppo 的抑制剂，但由于nahsos对人体健康是有

26、害的，大量使用亚硫酸钠类添加剂会 破坏食品的营养素。亚硫酸盐能与氨基酸、蛋白质等反应生成双硫键化合物; 能与多种维生素b" bd、c、d结合，能够使细胞产生变界；会诱导不饱和脂 肪酸的氧化厲】。生产实践中要参考食品添加剂的国家使用标准。3.5.4 edta-2na对ppo活性的彩响图9 edta-2na对ppo的影响edta-2na是常用的金属络合物质，可以络合cu2+ , edta-2na的加入可以 抑制多酚氧化酶的活性。由图9可知，随着edta-2na浓度增加，吸光度值减小, 当edta-2na质量浓度达到0.06mol/l时，就可对酶活力产生影响。浓度再增加 时，酶活力的变化趋

27、缓。因此，edta-2na对ppo活性抑制较弱。3.5.5四硼酸钠对ppo活性的影响120100806040200.10.2j0-5硼酸钠（）图10四硼酸钠对ppo的影响四硼酸钠是一种络合剂，它能络合金属离子以及隐蔽底物的邻二疑基不被多酚氧 化酶所作用，所以具有对多酚氧化酶较好的抑制作用卩叫 由图10知，四硼酸钠 对ppo对抑制作用随着其浓度的增加而增加，当浓度达到3%时就可全部抑制多 酚氧化酶的活性。3.5.6疏基乙醇对ppo活性的影响o o o o o o o o 2 0 8 6 4 2 3 sfr-i疏基乙醇(%)11蔬基乙醇对ppo的影响o2筑基乙醇对ppo的抑制是由于它们可与该酶活性

28、中心的铜原了键合旳，从 而抑制了更进一步的氧化和聚合卩"。由图11可知，筑基乙醇对对ppo表现出明 显的抑制作用，不同浓度的疏基乙醇随ppo的活性冇不同的抑制作用，并且随 着筑基乙醇浓度的增加，ppo活性迅速下降，其抑制率不断升高。在筑基乙醇为 1.0%吋，ppo相对活性仅为3.5%,几乎丧失了所有的酶活性。所以其抑制作用 强于抗坏血酸。但出于其为危险品，经皮肤、吞咽吸收有致命危险，刺激眼 睛、呼吸道粘膜，引起慢性咽炎，因此对人体有害，并且其价格昂贵，不适 宜投入生产实践。3.5.7铜试剂对ppo活性的影响40302010铜试剂(%)图12铜试剂对ppo的影响ppo的催化进程中，cu

29、2+是酶的活性中心，所以抑制ppo的活性可通过抑 制ppo中的6"含量来实现，albert和gledhill38j曾研究证明，铜试剂能与多 种金属作用生成沉淀，铜是其中一种，因此它是铜的螯合剂。当酶中加入抑制铜 试剂吋，由丁酶中含有的被铜试剂结合后，失去了对氧分子的结合能力， 使酶的活力大大下降，由此看来，铜试剂抑制板栗多酚氧化iw的活性，可能是由 于它与酶中的铜生成螯合物所致。从图12可看出，加入此抑制剂后ppo的活性大大下降了，并且随着铜试剂 的浓度越大，其对小麦ppo活性的抑制效果越好。3.5.8 硫腺对ppo活性的影响o o o2 0 81ao6o4o25oo53硫26图13

30、硫腺对ppo的影响由图13可知，抑制剂浓度为零吋（即无抑制剂存在），反应速度最大；有抑 制剂存在时，反应速度随着抑制浓度的壊加而降低。但硫腺的对ppo的抑制作 用很弱，ppo活性随硫啄浓度的增高变化幅度不大。3.5.9氯化钠对ppo活性的影响3掘史童图14 nacl对ppo的影响nacl溶液对多酚氧化酶的抑制效杲远不及抗坏血酸溶液的抑制效杲，其抑 制效果相对较差。由图14可知，nacl溶液可以一定程度地抑制褐变是由于多酚 氧化酶（蛋白质）变性，但乂因为盐能导致蛋白质的变性，是可逆过程，所以这 个效果不是很理想。如2%的nacl溶液只能抑制60%左右的ppo活力，这限制 了其在板栗加工处理中的应

31、用。3.5.10氯化钙对ppo活性的影响o o o o o o2 0 8 6 4 2图15氯化钙对ppo的影响ca"对ppo的影响可解释为其与ppo中的cu"的竞争列。由图15可知,cacl?对ppo几乎无抑制作用，如当cacl2浓度为3%时，对ppo的抑制仅为 40%左右。其原因可能是因植物体内含有抗坏血酸氧化酶所致，而钙可同氨基酸 结合为不溶性化合物，可以控制非酶褐变。4小结以分光光度计法对板栗屮的多酚氧化酶各项特性的测定结果表明，酶的最适 温度为 45°c；最适 ph 值为 5.4；最大反应速 vmax =40.82u/min,km =0.036mom； 十

32、种物质对该酶均表现出不同的抑制作用，抑制效果最强的抑制剂为抗坏血酸、 亚硫酸氢钠以及筑基乙醇。根据以上结杲，在板栗的加工中，采取降低温度、控 制ph值、适量添加亚硫酸氢钠、抗坏血酸、柠檬酸以及金屈络合剂如四硼酸钠、 edta-2na等护色措施，可以有效控制酶促褐变的发生。参考文献：1叶兴乾，张贵平.板栗多酚氧化酶性质的研究j.上海交通大学学报，2001,19(3) ： 174-178.21宋含平亦食亦药的栗子j.药膳食疗研究，1996,1： 35.田鸣华，同连第，韩长青.板栗粉的加工j食品工业科技，2002,23 (8)： 103-104.4 clausen m.r. , h., tvede

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