柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性VIP

1、柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性孙大光叫 郑雪芳2,刘波"，阮传清2,范国成2,夏育陆3, halld.4,段永平4(1福建师范大学生命科学学院,福州350108； 2福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心,福州350003； 3美国北卡州立大学冇害生物综合治理研究中心，美国；4美国农业部佛罗里达园艺试验室，死罗里达 34945)摘要：对红心柚、蜜桔、金桔内生细菌进行分离鉴定并做多样性分析，为研究柑橘内生细菌与柑橘病 害的牛:物防治奠定基础。平板分离法分离柑橘不同器官内牛细菌，采用美国midi微牛物鉴定系统鉴定菌 株，対内生细菌数量进行统计、分类，并作群落多样性分析。3种柑橘共分离得到的

2、内生细菌属于32个种, 隶属于仃个属。红心柚、蜜桔、金枯分别分离得到内生细菌10个属13个种，14个属22个种，12个属 21个种。不同种类细菌中芽砲杆菌属细菌含量最高,3种柑橘中金桔的内生细菌含量最高,不同器官中根 部的内生细菌含量最高。柑橘内牛细菌进行聚类分析表明oooooooocoooooooooo在不同柑橘和不同器官 中内生细菌的种类、数量和群落多样性存在较大差界。蜜枯叶片内生细菌的simpson (d)指数最高；蜜 桔叶片内牛细菌的shannon (川)指数最高；蜜枯根部内生细菌pielou指数最高。木研究丰富了柑橘内生 细菌资源，为柑橘内牛细菌的利川提供了物质基础，并对科学说明牛防

3、作川机理具有重要价值。关键词：柑橘内生细菌plfa多样性分布separation, identification and distribution of endophytic bacteria in citrussun da-guangb 2, zheng xue-fang2, liu bo2基金项目：国家公益性行业(农业)科研专项(no.20100306795)；中美合作项目柑橘木虱及黄龙病野外研究(no.20106524)2)、抗虫柑橘品种研究 (no.6618-22000-037-01s)；福建省财政专项福建省农业科学院科技创新团队建设基金(no.stlf-y03)作者简介：孙人光(19

4、87)»坍硕士研究生，主要从事植物内生菌的研究，e-mail： vvoshisdg 通讯作者(责任作者人刘波(1957),男,博士，研究员,从事微生物生物技术与农业生物药物研究'e-mail： iiubofaas,ruan chuan-qing2, fan guo-cheng2, xia yu-lu hall d.4, duan yong-ping41. college of life science fujian normal university, fuzhou 350108, china;2. citms huanglongbing research center, f

5、ujian academy of agricultural sciences, fuzhou 350003, china；3. the center of integrated pest management, north carolina state university, north carolina, usa；4. horticultural research laboratory (usda/ars), florida, 34945, u.s.aabstract: in order to ascertain the connection between citrus endopphyt

6、ic bacteria and the biological control about citrus disease, the study on the citrus endophyte's number, bacterial identification and community multiplicity analysis were conducted. the endophytic bacteria were isolated using the culture method and identified by microorganism identification syst

7、em (midi system produced by usa). 32 microbial species identified belonging to 17 genera of bacteria were detected from endophytic bacteria in citrus grandis osbeckcv, chinese honey orange and cumquat the content of bacillus was the most in all endophyte, cumquafs endophyte was the most among 3 thes

8、e citrus and the number of endophytic bacteria in root was more than other organs. the cluster analysis results showed that 32 strains could be separated into 7 groups the community multiplicity and diversity of endophytic bacteria were significant different in 3 different citrus.keyword： citrus； en

9、dophytic bacteria； plfa； community multiplicity柑橘是世界第一大果树品种，全球有135个国家和地区牛产柑橘，2008年我国成为世界柑橘第一大国 山21。柑橘不仅仅口味宜人而且本身具有很多功能性物质，可广泛应用于功能性食品的开发、药物的开采及 一些功能性饲料的研制等。内生细菌(endophytic bacteria)是指从经过表而消毒植物纽织分离得到并不会对植物木身造成实质性伤 害，而且在一定的程度上还会与植物建立和谐关系的细菌hq。其对植物的作用表现在很多方而，如有些内 生细菌町以产生植物激素促进植物生长，有些促进植物生物固氮作用【7】，有些可以产

10、住抗住素增加植物对 抗病原菌和外來寄牛虫的抵抗能力轧了解内生细菌与植物生长之间的关系，并且能够将这些关系应用到 农业主产、保护牛物多样性以及保持农业牛态平衡具有重要的意义冏。自1866年de bary将生活在植物组织内的微生物与植物表面的微生物相区别以来，植物内生菌作为一 种新的微牛物资源受到了广泛关注【训。据不完全文献统计，冃前已从甜菜】、牧草冏、小麦冏、水稻卩4、 马铃薯阴等近30种植物中分离了近60个属的内生细菌卩6】。罗永兰等从柑橘植株中分离得到多种内生细菌 问。张翼等从柑橘枝条中分离得到枯草芽孑包杆菌(bacillussubtilis)ys45菌株对油菜菌核病(sclerotinia

11、 sclerotiorum)具有拈抗作用。araujo等从甜橙屮分离得到短小杆菌(curtobacteria flaccumfaciens可以抑制 柑橘杂色褪绿病(citrus variegated chlorosis,cvc)菌(xy/e/a fastidiosa)的生长。冃前对柑橘内生细菌的研究主要集中在内生菌的分离、鉴定、生物防治、促生因了、抑菌活性物质分 析等方而口勿，而国內外对柑橘内生细菌群落结构的研究比较少见。本研究采用美国midi微生物鉴定系统 对不同品种柑橘植株分离的内生细菌进行鉴定，了解内生细菌在柑橘植株不同品种和不同部位的分布特 性，为柑橘内住细菌相互关系的研究和内牛细菌资

12、源开发利用奠定基础。1材料与方法1.1材料供试的柑橘植株为2010年7刀23 口在顺昌北门水库边赵氏园艺技术研究所果树棊地采集的3个柑橘 品种，分别为红心柚(c/7ri/sgicfeosbeckcv.chander),蜜桔(citrusunshiumarc)和金桔(fortunellamargarita (lour.) swingle)o采集方法，选择一株具有典型黄龙病病症的红心柚(citrus grandis osbeck.chandler), 分别从植株东面、南面、西面、北面取其上部、中部、下部共12个部位叶片、枝条及其根部。将供试材 料立即带回实验室并进行处理。na培养基、tsb培养基、

13、脂肪酸提取处理试剂、气相色谱系统、分析软件、均参考蓝江林等创的方法。 试剂：甲醇，正已烷甲基叔丁基乙噬(fisher公司)，盐酸，氮氧化钠(优级纯)，脂肪酸混合标样(c9至 c20),去离子水。1.2方法1.2.1柑橘内生细菌的分离与数量统计分别称取叶片5g,首先将叶片用自来水冲洗干净,吸干叶片表面的水,在75%酒精里浸泡30s,接着 用10%次氯酸钠浸泡5分钟，再用无菌水漂洗叶片3次。为了检验表面灭菌的效果，用灭过菌的锻子夹着 叶片是叶片表面与na平板接触2min然后放在30°c培养2d,若发现平板上没有菌落出现，证明该叶片表而 灭菌彻底，改样殆得到的结果可信，否则该分离结果不能使

14、用。无菌操作将叶片剪碎至于研钵里并加入45ml无菌水，充分研磨匀浆制成10-1样品原液，静置30mino 依次将原液稀釋至10-2, 10-3,取200pl加到na平板上，涂布至平板干燥，试验重复3次。将涂布后的na 平板至于28°c的培养箱培养24h,观察菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征。.挑取 各部位具有代表性的单菌落，并计数、纯化、20%甘汕80°c保存分离得到的菌株。根据内牛细菌菌落形态结构等特征，对不同柑橘植株和不同器官中内牛细菌出现的数量进行统计。内 生细菌含菌量(cfu-g-tw)即每克柑橘鲜重组织经培养后产生的菌落个数。1.2.2细菌种类

15、鉴定(脂肪酸鉴定法)细菌鉴定通过美国midi公司开发的全自动微牛物鉴定系统sherlock mis鉴定，脂肪酸提取，脂肪酸的 检测参考蓝江林等方法【2叽1.2.3柑橘内生细菌的聚类分析参考车建美等【22方法，以分离到的内生菌菌株为样木，以各菌株在不同柑橘器官中的含量指标，组成 数据矩阵，将所得数据输入dps 7.05数据处理系统，采川马氏距离为聚类尺度，以类平均法对数据进行系 统聚类分析，并口动生成各供试菌株的聚类图和相界系数表。1.2.3柑橘内生细菌的群落多样性指数柑橘各器官(叶、茎、根)内生细菌种群多样性指数分析，将不同器官内工细菌含量作为数量测 度,引入生态学多样性测度simpson (

16、d)指数、shannon (hj指数、pielou指数等方法。simpson (d) 计算公式为：d=1-zpi,式屮pi种内牛细菌占该试验小总的内牛细菌的个数比例。shannon (h7)计算公 式为：h1 -ipilnpi ,式中pi=ni/n, ni为处理i的内生细菌个数，n为该试验中总内牛细菌个数。s为某类 细菌i在供测样品中出现的次数。pielou指数（j）计算公式为:j=-ipilnpi/lns ,式中s为群落中的内生细 菌的总种类数。2结果和分析2.1柑橘内生细菌分离与鉴定按照菌落形态差界，从红心柚根、枝条、叶分別分离得到5、27、37株内生细菌；蜜桔根、枝条、叶 分离得到7、1

17、8、32株内生细菌;金桔根、枝条、叶分离得到5、21、32株内生细菌,共184株。利川微牛物鉴定仪（midi）鉴定结果表明，具屮相似系数人于0.500的菌株有139株，这些菌株属于 32个种，隶属于17个属（表2）,分别是bacillus （芽他杆菌属）、staphylococcus （葡萄球菌属）、brevibacillus （短芽砲杆菌属）、sphingomonas （鞘脂单胞菌属）、acinetobacter （不动杆菌属）、microbacteria （微杆菌 屈）、cmobacferb（短小杆菌属）、brevwd肪ocas（短波单胞菌属）、pset/domoas（假单胞菌属）、met

18、hylobacteria （甲基杆菌属）、pecfobacfe4（果胶杆菌属）、arthrobacterc 节细菌属）、sphingobiumc 勒脂菌属）、stenotrophomonas （寡养单胞菌属）、cedecea （西地西菌属）、delftia （代尔夫特菌属）、zoogloea （动胶菌属）。其中芽他 杆菌属包含有6个种，staphylococcus （j萄球菌属）、spm）gomo/?ms （鞘脂单胞菌属）、acinetobacter （不动 杆菌属）和methylobacteria （甲基杆菌属）各包含有3个利x brevibacillus （短芽孑包杆菌属）和arthrob

19、acter （节 细菌属）各包含有2个种，其余的10个属各包含1个种。表2柑橘内生细菌鉴定结果table 2 the identification of endophytic bacteria from citrus菌株编号number of strains属genus name种名species name中文名称chinese name相似系数similarity n amefjat-10615bacillus （芽鞄杆菌属）bacillus cereus蜡样芽胞杆菌0.744fjat-10632bacillus （芽泡杆菌属）bacillus megaterium巨大芽他杆菌0.813fj

20、at-10433bacillus （芽抱杆菌属）bacillus subtilis枯草芽抱杆菌0.692fjat-11012bacillus （芽抱杆菌属）bacillus viscosus稠性杆菌0.778fjat-10619bacillus （芽抱杆菌属）bacillus pumilus短小芽抱杆菌0.699fjat-10800bacillus （芽他杆菌屈）bacillus thuringiensis苏云金芽他杆菌0.675fjat-10161staphylococcus （徊萄球菌属）staphylococcus hominis人葡萄球菌0.835fjat-11086staphyloc

21、occus （衙萄球菌属）staphylococcus cohniicohnii科氏科匍萄球菌0.695fjat-10417staphylococcus （匍萄球菌属）staphylococcus arlettae阿尔莱特葡萄球菌0.5fjat-10623brevibacillus （短芽也杆菌属）brevibacillus parabrevis副短短芽抱杆菌0.657fjat-10620brevibacillus （短芽泡杆菌属）brevibacillus choshinensis桥石短芽他杆菌0.737fjat-10617sphingomonas （鞘脂单胞菌屈）sphingomonas

22、capsulata暂无0.852fjat-10625sphingomonas （幣脂单胞i杲j屈）sphingomonas paucimobilis少动鞘氨醇单胞菌0.709fjat-11010sphingomonas （鞘脂单胞菌属）sphingomonas sanguinis血红鞘氨醇单胞菌0.795fjat-10162acinetobacter （不动杆菌属）acinetobacter baumannii鲍氏不动杆菌0.546fjat-11022acinetobacter （不动杆菌属）acinetobacter genomospecies暂无0.753fjat-11007acineto

23、bacter （不动杆菌属）acinetobacter calcoaceticus醋酸鈣不动杆菌0.622fjat-10421microbacteria （微杆肖屈）microbacteria chocolatum何无0.64fjat-11094curtobacteria （短小杆菌属）curtobacteria flaccumfaciens萎蔦短小杆菌0.813fjat-10635brevundimonas （知波单胞菌属）brevundimonas vesicularis泡囊短波单胞菌0.836fjat-10818pseudomonas （假单胞菌属）pseudomonas putida恶

24、臭假单胞菌0.691fjat-10634methylobacteria （屮丿衣杆菌属）methylobacteria organophilum嗜冇机甲基杆菌0.884fjat-10427methylobacteria （屮棊杆菌属）methylobacteria rhodesianum何无0.874fjat-10425methylobacteria （甲基杆菌属）methylobacteria mesophilicum嗜中温甲基杆菌0.918fjat-11084pectobacteria （果胶杆菌属）pectobacteria carotovorum暂无0.781fjat-10618art

25、hrobacter （ ij 细菌属）arthrobacter aurescens金黄节杆菌0.745fjat-11091arthrobacter （节细菌届）arthrobacter histidinolovorans暂无0.912fjat-10629sphingobium （鞘脂菌属）sphingobium yanoikuyae暂无0.795fjat-10420stenotrophomonas （寡养单胞询屈）stenotrophomonas maltophilia嗜麦芽寡养单胞菌0.783fjat-11013cedecea （西地西菌属）cedecea davisae戴氏西地西菌0.69

26、3fjat-10430delftia （代尔夫特菌属）delftia acidovorans食酸代尔夫特菌0.82fjat-10636zoogloea （动胶菌属）zoogloea ramigera枝状动胶菌0.5722.2内生细菌在柑橘品种间的分布（1）内生细菌在柑橘品种间的数量分布不同柑橘内生细菌含量有差别（见图1）。金桔内生细菌含量最高达到2.6953x105 cfu g-1,其次是红心 柚内生细菌含量,达8.821x104 cfu g-b蜜桔内生细菌含量最低,为7仃7乂伸cfugj红心柚蜜桔金桔严§oixw住糰焉刖庄图1不同柑橘内生细菌含量图fig 1 the content

27、 and distribution of endophytic bacteria isolated from citrus（2）内生细菌在柑橘品种间的种类分布不同内牛细菌在3种柑橘中含量有很大差界（图2）,其中芽砲杆菌属内生细菌为优势菌株，英含量在 3种柑橘中的含量均为最高，芽抱杆菌在红心柚、蜜枯和金枯中的百分含量分别为30.88%、23.76%和30.00%0 而在3种柑橘中都存在的內生细菌bacillus （芽他杆菌属）、brevibacillus （短芽泡杆菌属）、sphingomonas （勒脂单胞菌属）、acinetobacter （不动杆菌属）、curtobacteria （短小杆

28、菌属）、arthrobacter （节细菌属）。红心柚屮不同内住细菌含量从高到低依次bac/7/us（27.25x103cfu-g-1）> sfap/）y/ococcs（ 10.82x103cfug）、 curtobacterium （10.32xl03cfug-1）、pseudomonas （9.62103cfu*g-1）、stenotrophomonas （9.41xlo3cfu*g-1）、 brevibacillus （6.49x103cfu*g-1）、（6.47x103cfu«g-1） x spwngomonas （3.64x103cfu«g-1） >

29、pectobacteria （2.49x103cfu-g-i）、acinetobacter （2.45x103cfu*g-9 。(h2x)*如b專4hm27. 252.45®61團39 62-120-112 111hu947壬沁書农竺62.49園1141手黑应农卅工9 frrfmm图2内生细菌在不同柑橘中含量分布图fig 2 the content of endophytic bacteria in different citrus注：1-17 表示 bacillus. staphylococcus. brevibacillus. sphingomonas. acinetobacte

30、r. microbacteria. curtobacteria. brevundimonas. pseudomonas、methylobacteria. pectobacteria. arthrobacter、sphingobium. stenotrophomonas cedecea.delftia. zoogloea蜜枯中不同内生细菌含量从高到低依次是 bac/us( 17.05x103cfu-g-0> /wef/)ytobacter/a( 10.54x1 ocfu-g-i) > sph/ngomonas (8.52x103cfu-g-1) pectobacfer/a (4.78

31、x103cfu*g-1) > /tohefobacfer (4.67x1 (pcfugj)、arthrobacter (4.35x103cfu-g-1)、m/crobacfer/a (3.96x103cfu-g-1)、de/fta (3.43x103cfu-g-9、brev/bac/7/us (3.27x1 ocfu-g-1).stenotrophomonasc 3.21x103cfu-g-1)、curto bacterial 2.76x103cfu-g-1)、sphingobiumc 2.19103cfu*g-1)、brevundimonas (1.92xlo3cfu*g-1)、sta

32、phylococcus (1.26x103cfueg-1)。0 8 6 4 2oq 11 11 1117.05图2内生细菌在不同柑橘中含量分布图fig 2 the content of endophytic bacteria in different citrus1 08 6 4 2 o-2注：1-17 表示 bacillus> staphylococcus. brevibacillus. sphingomonas. acinetobacter. microbacteria、curtobacteria. brevundimonas. pseudomonas. methylobacteri

33、a. pectobacteria. arthrobacter. sphingobium. stenotrophomonas cedecea. delftia. zoogloea在金桔屮不同内牛细菌含量从高到低依次是bacillus (80.86x103cfu-g-1)、brevibacillus (46.95x103cfu*g-1)、acinetobacter (26.95 x 103cfu*g-1)、pseudomonas (23.48 xio3cfu*g-1)、curtobacteria (18.48x 103cfu*g-1)、sphingomonas (15.84 x103cfu*g-1

34、)、sphingobium (14.48 x103cfu*g-1)、brevundimonas (11.48 x103cfu-g-1)、methylobacteria (9.48x103cfu-g-1)、cedecea (9.48 x103cfu-g-1)、arthrobacterc &48 x10cfu-g-1)、 zoogloea (3.48x 103cfu*g-1)。图2内生细菌在不同柑橘中含量分布图 fig 2 the content of endophytic bacteria in different citrus注：1-17 表示 bacillus. staphyloco

35、ccus brevibacillus、sphingomonas、acinetobacter microbacteria、curtobacteria. brevundimonas.pseudomonas. methylobacteria. pectobacteria. arthrobacter. sphingobium. stenotrophomonas. cedecea.delftia. zoogloea2.3内生细菌在柑橘器官中的分布（1）内生细菌在柑橘器官中的数量分布柑橘不同器官内生细菌含最有旁异，结果见图。红心柚叶片、枝条和根部内生细菌含菌量规律为 根部枝条二叶片。蜜桔叶片、枝条和根部内

36、生细菌含菌量规律为根部r|ji枝条。金枯叶片、枝条和 根部内生细菌含菌量规律为根部枝条叶片。25201510507$21citrus grandis osbcckcvchinese honey orangecumquat根 rootid 枝条 branch 叶片leaf红心柚蜜桔金桔-5图1不同柑橘内生细菌含量图fig 1 the content and distribution of endophytic bacteria isolated from citrus（2）内生细菌在柑橘器官小的种类分布图3所示，在红心柚根部、枝条和叶片分别分离得到内牛细菌2个属3个种，4个属5个种，6个属9 个

37、种。蜜枯根部、枝条和叶片分别分离得到内生细菌2个属5个种,6个属7个种山个属16个种。金枯根 部、枝条和叶片分别分离得到内生细菌2个属4个种,6个属10个种山个属18个种。从柑橘植株的下部器 官到上部器官，内牛:细菌的种类是呈现上升趋势的，且叶片和枝条内牛细菌种类个数均为金桔蜜桔红心柚，而在根部种类个数则是蜜枯金枯红心柚。(黒)m红心柚蜜桔冈金桔图3柑橘不同器官内生细菌种类含量图fig 3 the category and content of endophytic bacteria in citrus2.3柑橘内生细菌聚类分析柑橘内生细菌在不同品种柑橘中的分布情况统计结果见图4。根据不同部位

38、内住细菌的数量关系采用马氏距离，类平均法做出的聚类分析看不出什么规律。表3柑橘内生细菌的种类和分布table 3 the distribution of endophyte bacteria isolated from different citrus红心柚citrus grandis osbeckcv蜜桔chinese honey orange金桔cumquat编号number根枝叶rootbranchleaf根root枝叶branchloaf根root枝branch叶leaffj at-10615000.83x1032.56x1030005.77x1033.75x103fjat-10632

39、9.78x1032.56x1031.78x1032.73x1031.73x1030.65x1039.58x1034.53x1034.33x103fjat-104330003.56x1030.86x1031.47x10311.77x1036.33x1032.17x103fjat-1101200000005.78x103563x103fjat-10619000000005.69x103fjat-108007.73x1034.57x10303.79x1030015.63x10300fjat-10161003.08x103000000fjat-11086004.17x10301.26x1030000f

40、jat-10417003.57x103000000fjat-10623006.49x103003.27x1036.95x10311.41 x10319.37x103fjat-106200000000027.48x103fjat-10617003.64x103002.05x103005.43x103fjat-10625000001.16x1030010.41x103fjat-11010000000015.84x1030fjat-10162002.45x103000000fjat-11022000001.45x10301.66x1032.21x103fjat-11007000003.22x1030

41、1.45x1033.16x103fjat-10421000003.96x103000fjat-11094010.32x103001.35x1031.21x103018.48x1030fjat-1063500001.3x1030.62x1030011.48x103fjat-1081809.62x10300000023.48 x103fjat-10634000003.92x103009.48x103fjat-10427000003.25x103000fjat-10425000003.37x103000fjat-11084002.49x10304.78x1030000fjat-106186.47x1

42、03004.35x10300008.48x103fjat-1109100004.35x1030000fjat-10629000002.19x1030014.48x103fjat-1042009.41x1030003.21x103000fjat-1101300000009.48x1030fjat-10430000003.43x103000fjat-10636000000003.48x103注:"1"代表在此部位存在0”代表不存在't'means it is in this part, "omeans not existfjat-10615fjat-1

43、0433fjat-11012fjat-10632fjat-10800fjat-10619fjat-10636fjat-10620fjat-11013fjat-10161fjat-11086fjat-10162fjat-10417fjat-10617fjat-11010fjat-10625fjat-11022fjat-10623fjat-11007fjat-10425fjat-10427fjat-10430fjat-10421fjat-10634fjat-10635fjat-10629fjat-11094fjat-10818fjat-11084fjat-10618fjat-11091fjat-1

44、04200.0015.6731.3547.0262.7078.37图4柑橘内生细菌聚类分析2.4柑橘不同器官内生细菌群落多样性指数柑橘内生细菌群落结构的多样性分析：柑橘不同器官内生细菌的群落多样性指数不同，蜜桔叶片的simpson(d)指数最高为0.9235,红心柚根部最低为0.6570；蜜桔叶片的shannon(h/)指数最高为3.8203, 红心柚根部最低为1.5641；蜜枯根部pielou指数最高值为0.9879,蜜枯枝条最低为0.8956。农4柑橘不同器官内生细菌群落多样性指数table 4 diversity index of endophytic bacterium in diff

45、erent citrus organs植物器官organsimpson (d)shannon(h)均匀度（j）红心柚根0.65701.56410.9869枝0.76332.17110.9350叶0.86333.00340.9475蜜桔根0.79232.29380.9879枝0.79292.51440.8956叶0.92353.82030.9551金桔根0.72911.93950.9698枝0.85512.99470.9015叶0.90493.68950.90263讨论细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两人类，随着科技的发展，一系列商品化占动 鉴定系统和继推出，如vitek系统、m

46、idi系统、biolog系统、sensititre系统、autosceptor系统以及 microsca系统等【23 24,其中细胞脂肪酸分析的midi系统、碳源利用分析的biolog系统与dna序列分析的 16srna基因进化发冇系统已经成为目前国际上细菌多相分类鉴定常用的技术手段阿26。midi系统主耍根 据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, plfa）的类型和含屋具冇种的特异性、指示性 和遗传稳定性筹特殊性能对微牛物进行全h动鉴定和分析rd。本研究采用常规分离法分离得到140株内生细菌，通过midi系统鉴定技术，其中相似性系数大于0.500

47、 的菌株冇109株，属于32个种，隶属于17个属。在所分离得到的内生细菌中还冇31株的si系数小于0.500, 并不能确定其种属，所以柑橘中的内生细菌资源有很大的开采空间。不同品种柑橘和不同器官内生细菌的 丰富度和种群数量有很大差界，内半细菌含量金桔红心柚蜜桔，不同的内牛细菌在不同种类的柑橘中岀 现的频次不同，这可能是内住细菌对宿主的选择性及适应性所导致的结果；柑橘不同器官内住细菌含量也 很人差异，叶片、枝条和根部内生细菌含菌最规律为根部内生细菌含量均人于枝条和叶片内生细菌的含最 这与罗永兰等m的结果相符合。内生细菌中bacillus （芽抱杆菌属）和pseudomonas （假单胞菌属）为最

48、常见菌属，且芽抱杆菌的含量 是最大的閱。与罗永兰等m研究相比较，木研究得到的柑橘内生细菌只有bacillus（芽孑包杆菌属）和 pseudomonas （假单胞菌丿咸）其得到的结果相同，这说明不同品种柑橘内生细菌的种类是有所差异的。红 心柚、蜜桔、金桔分别分离得到内生细菌植物内生菌的分布与群落结构不仅与植物的种类、基因型冇关，还与植物的生长阶段、环境条件冇关，存在复杂的多样性【29】。已有研究表明，staphylococcus （葡萄球菌属）、microbacteria （微杆菌属）、acinetobacter （不动杆菌属）、 curtobacteria （短小杆菌属）细菌存在于奥林达夏橙中

49、曲。brevibacillus （短芽孑包杆菌属）、methylobacteria （甲基杆菌属）卩2、pectobacteria （果胶杆菌属）旳、arthrobacter （节细菌属）【判、stenotrophomonas （寡养单 胞菌属）"i、brevundimonas （短波单胞菌属）、sphingobium （鞘脂菌属）阳、cedecea （西地西菌属）何、 delftia （代尔夫特菌属）网、zoogloea （动胶菌属）砌等，这些细菌作为内生细菌已经从不同的植物中分离 到，且有些细菌生物学特性都已有不同程度的研究。araujo等阳在研究内生细菌与木质部难养菌（xyle

50、lla fastidiosa）的相互作用时发现，在被xy/e/afasd/osa侵染而不表现症状的柑橘植株中，内生细菌-curtobacterium flaccumfaciens的数量相比健康植株人量增加，而且能够减轻由x. fastidiosa引发的症状。microbacterium （微杆 菌属）能够合成黄原胶降解酶，将植物病原菌野汕菜黄单孑包菌分泌的毒素因子黄原胶分解，生成一些具冇 抗微生物生长的物质【39】。冇大量研究表明内生细菌群落结构打自身生长环境，营养条件，遗传背景冇关曲。多样性指数町做为 度量微牛物群落多样性高低的指标。陈俊华等的指岀shannon （h1）指数反映群落物种丰富

51、度，simpson(d)指数反映群落中物种的多少，pielou指数反映群落物种均匀度。本研究发现柑橘不同器官的内牛细菌 群落多样性不同，柑橘内生细菌群落结构的多样性分析：柑橘不同器官内生细菌的群落多样性指数不同， 蜜桔叶片内生细菌的simpson (d)指数最高,红心柚根部最低;蜜桔叶片内生细菌的shannon (比)指 数最高，红心柚根部最低；蜜桔根部内生细菌pielou指数最高，蜜桔枝条最低。本研究从3种柑橘健康植株为样品，分析了福建顺昌柑橘植株内牛细菌的群落多样性，获得到健康柑 橘植株内生细菌的优势种群，并了解不同柑橘内生细菌的群落多样性及其分布特性，为深入研究内生细菌 与柑橘植株生长z

52、间的相互作用提供了理论基础。4参考文献1 张琨，钟晓红.柑橘功能性成分研究进展j.中国农学通报,2009,25(11):137-140.2 冉徳森，周国斌.我国柑橘产业发展前景预测j.湖北植保,2009(005):43-44.3 陈仕俏,赵文红,白卫东.我国柑橘的发展现状与展望j.农产品加工.学刊,2008(003):21-24.4 hallmann j, quadt-hallmann a, mahaffee w f, et al. bacterial endophytes in agricultural crops j. canadian journal of microbiology, 1

53、997, 43(10):895-914.5 di fiore s. endophytic bacteria: their possible role in the host plant s di fiorel and m del gallo dept, of food technology, environmental and microbiological sciences, university of molise, 86100 campobasso, italy j. azospirillum 6 and related microorganisms, 1995:1696 khan z,

54、 doty s l. characterization of bacterial endophytes of sweet potato plants j. plant and soil, 2009, 322(1):197-207.7 singh r, mishra r, jaiswal h. role of rhizobial endophytes as nitrogen fixer in promoting plant growth and productivity of indian cultivated upland rice (oryza sativa l.) plants j. biological nitrogen fixation, sustainable agriculture and the environment, 2005:289-291.8 strobel g, daisy b. bioprospecting for microbial endophytes and their natural products j. microbiology and molecular biology reviews, 2003, 67:4919 strobel g, daisy b. bioprospecting for microbial en