宫颈癌患者外周血淋巴细胞亚群分布的差异分析

1、宫颈癌患者外周血淋巴细胞亚群分布的差异分析摘要目的检测分析宫颈癌患者外周血淋巴细胞亚群的差异分布及临床意义。方法 采用流式细胞术检测宫颈癌患者和 健康对照成人外周血中cd3+、cd3+cd4+、cd3+cd8+、nk、nkt、cd8+cd28+. cd8+cd28-、 cd3+hla-dr+、 cd3-hla-dr+、 treg 细 胞的百分比，同时结合宫颈癌患者的临床诊断分期做对比分析。结果 与健康对照组比较，宫颈癌患者外周血中cd3+（p二0. 0002）和 cd3+cd4+ t 细胞百分比(p=0 0004)以及 cd3+cd4+/cd3+cd8+比值（p二0.0256）显著降低；宫颈癌

2、患者cd3+cd8+ t细胞百分比与对照组比较无显著差异，但是随着患者临床分期的提高呈降 低趋势（p二0.0480 ）。nk细胞（p00001 ）、活化t细胞(cd3+hla-dr+: p<0. 0001 )> 活化 b 细胞 (cd3-hla-dr+:p二0.0021)百分比显著提高；细胞毒性t细胞(cd8+cd28+)细胞百分比降低（p二0.0006）,抑制性t细胞（cd8+cd28-）百分比 提高（p二0.0009）； cd4+cd25brightt 细胞（treg）阳性细胞百 分比与对照组比较没有显著差异，但cd4+cd25brightt细胞（treg ）在cd4+淋巴细胞

3、中的百分比显著高于对照组（p二0.0335）。宫颈癌患者外周血中cd8+cd28-/cd8+cd28+之比与对照组比较显著提高（p<0. 0001）o结论 宫颈癌患者细胞免 疫功能降低。精确分析宫颈癌患者的t淋巴细胞亚群变化对于临 床诊断、治疗和预后评估具有重要的实际意义。关键词宫颈恶性肿瘤；淋巴细胞亚群；流式细胞术；肿瘤免疫中图分类号r737. 3 文献标识码a 文章编号1673-9701 (2016) 24-0020-05analysis of the differences of distribution of lymphocyte subsets in peripheral bl

4、ood in the patients with cervical canceryu hongl zhang gengyuel jin yulongl di nal he chunyingl wei tianxuel du renqiu21. cell biology research office, jilin research center for tumor prevention and control, changchun 130012, china； 2.disease record room, jilin tumor hospital, changchun 130012, chin

5、aabstract objective to test and analyze the differences of distribution of lymphocyte subsets in peripheral blood in the patients with cervical cancer and its clinical significance methods percentages of cd3+, cd3+cd4+, cd3+cd8+, nk, nkt, cd8+cd28+,cd8+cd28-,cd3+hla-dr+, cd3-hla-dr+, treg cells were

6、 tested in adult peripheral blood in the patients with cervical cancer and health controls via flow cytometry. comparative analysis was conducted in combination with the clinical diagnosis staging in the patients with cervical cancer resuits compared with the healthy control group, the perce nt ages

7、 of cd3+ (p二0.0002) and cd3+cd4+ t cells (p二00004) in the peripheral blood in the patients with cervical cancer and cd3+cd4+/cd3+cd8+ ratio (p二0. 0256) were signi.ficantly reduced ； the percentages of cd3+cd8+ t cells in the patients with cervical cancer were not statistically significant compared w

8、ith that in the control group, but with the increase of clinical staging, the percentage was in a decreasing trend (p二0.0480) the percentages of nk cells (p<0. 0001 ), activated t cells (cd3+hla-dr+: p<0.0001), and activated b cells (cd3-hla-dr+： p二0. 0021) were significantly improved； the per

9、centage of toxic t cells (cd8+cd28+ ) was reduced (p=0. 0006), and the percentage of inhibitive t cells(cd8+cd28-) was increased (p二0.0009)； the percentage of cd4+cd25bright (treg) cells was not significantly different from that in the control group, but the percentage of cd4+cd25bright (treg) cells

10、 in cd4+ lymphocytes was significantly higher than that in the control group (p=0. 0335) cd8+cd28-/cd8+cd28+ ratio in the peripheral blood in the patients with cervical caner was significantly increased compared with that in the control group ( p0 0001 ) conclusion cell immunological function is red

11、uced in the pa/tients with cervical cancer accurate analysis of the changes of t lymphocyte subsets in the patients with cervical cancer has important and practical significance in clinical diagnosis, treatment and prognosis evaluation. key words cervical malignant tumor； lymphocyte subsets；flow cyt

12、ometry； tumor immunology宫颈癌是女性中最常见的肿瘤，也是导致女性癌症死亡的首要原因之一。其发生发展与免疫功能尤其是细胞免疫功能失调密 切相关。此外，宫颈癌的预后也与肿瘤浸润淋巴细胞中存在的免 疫细胞类型有关，如细胞毒性cd8+ t细胞、cd4+ t细胞、调节性t细胞等，具体涉及它们的数量、功能状态及肿瘤细胞表达的 相关配体等等1。本研究采用流式细胞术检测宫颈癌患者和健 康成人外周血中总t淋巴细胞(cd3+)、t辅助/诱导细胞(cd3+cd4+)、t抑制/细胞毒细胞(cd3+cd8+)百分比、自然杀伤细胞(nature k订ler cells, nk)、nk 样 t 细胞

13、(nkt)、细 胞毒性t细胞(cd8+cd28+)、抑制性t细胞(cd8+cd28-)、调节 性 cd4+cd25brightt 细胞(treg)、活化 t 细胞(cd3+hla-dr+)、 静止t细胞(cd3+hla-dr-)、活化b细胞(cd3-hla-dr+)的百 分比，计算并比较cd3+cd4+/cd3+cd8+比值，同时结合宫颈癌患 者的临床诊断分期做对比分析，为临床诊断治疗提供实验依据。 1资料与方法1.1 一般资料选择吉林省肿瘤医院2014年1月2015年12月期间经病 理确诊为宫颈癌(鳞癌和腺鳞癌)且未经手术、放化疗的住院患 者306例，排除严重感染或自身免疫病病例。患者平均年

14、龄 (51.62土6.88)岁(年龄范围2175岁)。健康对照来自本院 体检人群，共56例，均为女性，平均年龄(49. 61±6, 60)岁(年 龄范围2571岁)。两组年龄等一般资料比较，差异无统计学意 义(p>0. 05),具有可比性。患者的临床基本信息见表1。表1宫颈癌患者的基本临床信息(n=306)1.2方法1.2.1试剂 荧光标记的抗人抗体 cd45-fitc/cd4-rd1/cd8-ecd/cd3-pc5 (catalogno： 6607013), cd3-fitc/cd16+56-pe ( catalog no :a07735),cd3-fitc/hla-dr-p

15、e(catalog no： a07737), cd8-fitc (catalog no： a07756), cd28-pe(catalog no： im2071u), cd4-fitcccatalog no： a07750), cd25-pe (catalog no： a07774), 0ptilysec lysis solution (catalog no： a11895)均为贝克曼公司产品。1.2.2样本制备 每个样本采集2 ml静脉血。按照试剂说明 书操作。每100 pl外周血加510 pl抗体，避光室温孵育 1520 min 后，0ptilysec lysis solution 裂解红

16、细胞，离心 后pbs洗1次，加500 u l pbs,上机检测。采用beckman coulterepics xl-mcl流式细胞仪,expo32 adc软件获取数据，收集10000 个细胞，expo32 v1.2软件分析数据。1. 3观察指标检测宫颈癌患者和健康成人外周血中总t淋巴细胞(cd3+)、t辅助/诱导细胞(cd3+cd4+). t抑制/细胞毒细胞(cd3+cd8+)百分比、自然杀伤细胞(nature killer cells, nk)、nk样t细胞(nkt)、细胞毒性t细胞(cd8+cd28+)、抑制性t细胞(cd8+cd28-)、调节性 cd4+cd25brightt 细胞(tr

17、eg).活化 t细胞(cd3+hla-dr+)、静止t细胞(cd3+hla-dr-)、活化b细胞(cd3- hla-dr+)的百分比，计算并比较 cd3+cd4+/cd3+cd8+ 比 值，同时结合宫颈癌患者的临床诊断分期进行对比分析。1-4统计学分析使用spss 17. 0和graphpad prism 5软件进行统计学分析。 计量资料数据以(x±s)表示。组间比较采用方差分析和独立样 本的t检验或mann whitney u检验，淋巴细胞亚群百分比与临 床分期的相关性分析采用spearman等级相关性分析，p<0. 05为 差异有统计学意义。2结果 2.1两组外周血中总t淋

18、巴细胞(cd3+)、t辅助/诱导细胞(cd3+cd4+)、t抑制/细胞毒细胞(cd3+cd8+)细胞百分比比较见图1,与对照组比较，宫颈癌患者外周血中cd3+和cd3+cd4+细胞百分比、cd3+cd4+/cd3+cd8+比值显著降低cd3+： (6175±813) % vs (69. 85±6.61) %； cd3+cd4+： (33. 30±3. 89) % vs (40. 22±7. 17) %； cd3+cd4+/cd3+cd8+： (1.59 ±0. 54) vs (195±068) 。iii/iv期宫颈癌患者的cd3+细

19、胞百分比均显著低于对照组；iv期宫颈癌患者的cd3+cd4+细胞 百分比显著低于对照组，说明宫颈癌患者外周血中cd3+和 cd3+cd4+细胞百分比的降低与临床分期的提高存在负相关趋势， 虽然spearman等级相关性分析结果表明差异无统计学意义(cd3+： r二-0.281, p二0.471； cd3+cd4+： r=0023, p二0.871)。 宫颈癌患者t抑制/细胞毒细胞cd3+cd8+： (25.21±5. 28) %) 细胞百分比的均值与对照组的(22.28±5.65)%比较，差异无统 计学意义(p=0.0872),但随着患者临床分期的提高呈降低趋势 i/ii

20、期：(27. 00±4. 07) %； iii/iv 期:(22. 04±4. 06) %；对 照组：(22. 28±5. 65) %) , spearman等级相关性分析结果显 示 r二-0.281, p二0.0480,差异有统计学意义(p<0. 05)o2.2两组外周血中 nk (cd3-cd16+56+)和 nkt (cd3+cd16+56+)细胞 百分比比较见图2,与对照组比较，宫颈癌患者组nk细胞百分比 (17. 64±3.81) %显著高于对照组(14. 12±4. 04) %,差异 有高度统计学意义(p0 0001)；nkt

21、细胞百分比(4. 30±1. 39)% 显著低于对照组(5.95±1.98) %,差异有高度统计学意义(p<0.0001)o2. 3两组外周血中活化t细胞(cd3+hla-dr+)、静止t细胞(cd3+hla-dr-)、活化 b 细胞(cd3-hla-dr+)百分比比较宫颈癌患者的活化t细胞(cd3+hla-dr+)和活化b细胞(cd3-hla-dr+ )百分比显著高于健康对照组cd3+hla-dr+:(9. 12±2. 98) %vs (5. 18±1.62) %, p<0. 0001； cd3-hla-dr+：(18. 27±5

22、. 45) % vs (13. 55±3. 15) %, p二0. 0021,静止 t 细胞(cd3+hla-dr-)百分比显著低于健康对照组(50. 52土 6. 87) % vs (63. 68±7.81) %, p<0. 0001,且活化 b 细胞(cd3-hla-dr+)水平的升高与临床分期存在正相关趋势，虽然 spearman等级相关性分析结果表明无统计学意义(r=0. 221, p=0. 124)； i /ii期：(16. 99±5. 25)%；m/iv期,20.02土7. 05)%； 对照组：(13. 55±3. 15) %,见图 3

23、。2.4两组外周血中细胞毒性t细胞(cd8+cd28+)、抑制性t细胞(cd8+cd28-)、调节性 cd4+cd25bright (treg)细胞百分比比较cd28是一个主要的共刺激受体，负责优化抗原介导的t细胞活化、增殖和存活。宫颈癌患者外周血中cd8+cd28+细胞阳性 细胞百分比降低(8.67±246) % vs (10. 88 ± 3. 95 ) %,p二0.0006, cd8+cd28-细胞百分比提高(17. 85±4. 28) % vs(12. 13±4, 01) %, p=0. 0009, cd4+cd25bright t 细胞(treg

24、)阳性细胞百分比与对照组比较无显著差异(3.74±1. 18) % vs(3.95±1.29) %, p二0.5514),见图 4。2.5两组外周血中cd8+cd28-/cd8+cd28+比值、cd4+cd25bright/cd4+细胞百分比比较宫颈癌患者外周血中cd8+cd28-/cd8+cd28+之比与对照组比较显著提高(1.99 + 0. 58) vs (1.47±0.46), p<0.0001；cd4+cd25brightt细胞(treg)在cd4+淋巴细胞中的百分比显著高于对照组(11.45±4. 28) %vs (9. 57±

25、3. 84) %, p二0. 0335(图 5)。3讨论宫颈癌是女性中最常见的肿瘤，尤其在发展中国家，是导致女性死亡率最高的肿瘤之一。已知宫颈癌的形成是由于人类乳头 瘤病毒(human pap订lomavirus, hpv)的持续感染造成的，因 此与清除病毒密切相关的免疫反应在宫颈癌的发生、发展和治疗 中起着更为重要的作用。大量的研究已表明癌症患者的肿瘤微环 境中的淋巴细胞亚群分布与患者的临床分期和预后关系密切，然 而在实际临床治疗中取材的困难限制了很多研究的深入进行2 。外周血采集方便，能够直接分析淋巴细胞亚群和其他细胞的百分比，从而评估患者的免疫状态、临床预后状况并预测疗效。此外，随着临床

26、检测技术的飞速进展，患者外周血中可检测到的 各种指标越来越多，精确度也越来越高，因此分析癌症患者外周 血淋巴细胞亚群分布具有重要的临床意义5-8 o本研究采用流式细胞术检测宫颈癌患者外周血淋巴细胞亚群分布，分析其与患 者临床分期的关系，为宫颈癌的诊断和治疗提供实验依据。在t淋巴细胞中，cd3+细胞代表了 t细胞的一般水平，反映宿主的细胞免疫状态。cd3+ t细胞又包括cd4+辅助/诱导性t细胞和cd8+细胞毒/抑制性t细胞。后者识别mhc-i类抗原并 通过前者分泌的细胞因子实现其调节免疫反应的功能。本研究中 我们共检测分析了 306例宫颈癌患者的外周血样本，结果表明,与健康对照组比较，宫颈癌患

27、者的cd3+和cd3+cd4+细胞百分比,cd3+cd4+/cd3+cd8+比值显著降低，处于晚期的癌症患者又比早期患者更低。这说明宫颈癌患者的免疫功能，尤其是与抗肿瘤相 关的细胞免疫功能降低9。nk细胞是大颗粒淋巴细胞，在机体的天然免疫中发挥重要 作用。nk细胞能直接破坏肿瘤细胞，其水平降低导致免疫功能 下降。本研究中我们检测的宫颈癌患者均未经手术、放化疗治疗, 其nk细胞百分比显著高于健康对照组，与文献报道一致10。说明宫颈癌患者在感染hpv病毒后机体的天然免疫防御机制发 挥了抵抗作用。与此相呼应，宫颈癌患者外周血中活化t细胞(cd3+hla-dr+)百分比也高于健康对照组，说明机体启动免

28、疫防御机制抵抗病毒的侵害。有报道表明b淋巴细胞的慢性活化是 有害的。我们检测到宫颈癌患者的活化b细胞(cd3-hla-dr+) 百分比高于健康对照组且活化b细胞水平的升高与临床分期的 提高呈正相关，对这一结果的阐释尚需进行更深入的作用机制研 究。抗肿瘤免疫反应非常复杂，不同类型的细胞之间相互作用, 彼此影响11-14 o已知一些t淋巴细胞有调节功能，如分泌 interleukin-10 的 t 细胞、分泌 tgf-b 的 t 细胞、cd4-cd8- t细胞、nkt 细胞、cd8+cd28-细胞、cd4+cd25+ regulatory t 细胞等。其中treg细胞具有免疫抑制作用，可以阻止其它

29、t细 胞的激活或扩增，抑制树突状细胞的抗原提呈能力，抑制nk细 胞活性,从而使肿瘤逃避免疫监视而进一步发展恶化o cd8+cd28-t细胞也是抑制性t细胞，抑制其他t淋巴细胞增殖和细胞毒性,其发挥免疫抑制作用主要通过分泌il-10和tgf- b等细胞因子。 本研究分析了是否cd8+cd28-、cd4+cd25+ treg细胞在宫颈癌患 者和正常人之间存在差异。结果表明，cd8+cd28-细胞在宫颈癌 患者中升高且宫颈癌患者外周血中cd8+cd28-/cd8+cd28+之比 与对照组比较显著提高。虽然二者的cd4+cd25+treg细胞水平没 有显著差异，但宫颈癌患者的treg细胞在cd4+淋巴

30、细胞中的百 分比显著高于健康对照组15, 16。 综上所述，本研究结果显 示，宫颈癌患者总体免疫功能下降且与临床分期关系密切。后续 的研究需要增加入组患者数量，增加检测指标，如foxp3、cd127、 cd69、ifn-y等17,同时需要深入研究患者的免疫功能状态与肿瘤进展和预后的相关性，为临床诊断治疗提供实验依据。参考文献1 nedergaard bs, ladekarl m, nyengaard jr, et al. a comparative study of the cellular immune response in patients with stage ib cervical

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