花生内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析

1、    花生内转录间隔区(its)的扩增及序列分析    杨 森摘要设计1对特异引物,以花生栽培种四粒红及其与野生种光叶花生的种间杂种为材料,对花生its1-5.8s-its2序列进行高保真pcr扩增,获得长度约800bp的单一条带,在对pcr产物进行克隆测序的基础上构建了花生属进化树。关键词花生;内转录间隔区(its)序列;pcr;进化树q789a 1007-5739(2009)08-0103-02内转录间隔区序列(its)广泛应用于被子植物系统进化研究,为禾本科、大豆属、棉属等植物的系统进化研究提供了宝贵的分子遗传学依据。花生rdna有关研究报道较少

2、,尽管有分离 rdna its的报道,但未在此基础上进行花生属植物的系统发育分析。本研究对花生its序列进行分离、测序,并将其与genbank中登录的花生its序列进行比较和分析,为花生的系统演化及花生的分类鉴定提供分子水平的证据。1材料与方法1.1材料试验所用花生为栽培种四粒红(silihong)及四粒红与野生种光叶花生的杂交后代(silihong×arachis glabrata benth.)高世代材料。花生种子取自山东省花生研究所莱西试验站。根据bhagwat等报道的its序列,使用软件dnas-tar.lasergene.v7.1设计1对特异引物:its1&2-15

3、-gtcgatgccgcacaaaccaggatt-3its1&2-25-cgggcacaacggggctctca-3这对引物的扩增区包含its1、5.8s和its2完整区域。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。1.2方法取35粒花生未成熟的叶片置于1.5ml离心管中,加40l 0.25mol/l naoh,用1ml枪头套一pcr管将叶片捣碎,煮沸30s,加160l含pvp-40的tris-hcl(ph值7.6),煮沸2min,10 000rpm离心5min,取上清液4保存,用时取1l作模板。取1-1d4-1、1-4d4-1、四粒红各品种未成熟叶片按上述步骤作简单处理,依次编号为1、2

4、、3作为pcr模板。pcr程序为:94 5min,(94 1min,52.1 1min,72 1.5min)30个循环,72 10min。先用takara taq dna聚合酶作pcr,确定有预期分子量大小的条带后再用高保真pfu dna聚合酶扩增,切胶回收dna,连接转化后挑取阳性克隆测序。利用dnastar.lasergene.v7.1进行多序列比对。用mega4.0软件以拟南芥核rdna序列为外群组(outgroup),采用3种方法(nj、me、mp)构建进化树,并进行bootstrap analysis 1 000检验2。2结果与分析2.1its区序列的pcr扩增以总dna为模版,利用

5、所设计的 2条引物pcr扩增出its区的特异性条带,分子量在800bp左右(图1),与genbank所登录的its序列片段长度相近。用taq dna pol pcr体系和pfu dna pol pcr体系所扩增出的its区序列片段电泳迁移率相同。2.2its1-5.8s-its2序列测定与多序列比对四粒红与野生种光叶杂交后代扩增产物6份穿刺培养物测序得到3条有差异的条带,分别命名为1-1、1-2、1-4。四粒红扩增产物测序后得到的序列命名为3-3。通过比对发现4条序列在its1-5.8s-its2区共有单核苷酸多态性位点14个,其中6个位于its1区,2个位于5.8s rdna中,6个位于it

6、s2区,其他植物上的研究认为5.8s rdna在进化上相当保守,而its1和its2则变化很大,本试验结果与这一结论一致。2.3花生属进化树构建通过nj、me和mp法构建花生属进化树,其拓扑结构大致相似,但也有所区别。总体看来,各个区组的材料分别聚集到一起,与基于传统形态学特征的花生属区组划分基本一致。从本研究所构建的3棵进化树来看,围脉(ex)区组、三籽粒(tris)区组、大根(c)区组在花生属中是比较原始的,花生区组(a)进化程度较高;gregory等根据花生属种间可交配性提出围脉(ex)区组、直立(er)区组和根茎(r)区组原根茎系较原始,而花生(a)区组、三籽粒(tris)区组、大根(

7、c)区组、异形花(h)区组、匍匐(p)区组以及根茎(r)区组真根茎系进化程度较高。研究结果表明,围脉(ex)区组、三籽粒(tris)区组和异形花(h)区组亲缘关系较近;直立(er)区组和三叶(trie)区组关系密切,两者与匍匐(p)区组形成一大的分支。在本研究构建进化树所涉及的花生材料当中,有3个未命名的种,其区组归属尚不明确,但从所构建的进化树上看,a.sp.dap-2004-1、a.sp.dap-2004-2应属于花生(a)区组,a.sp.dap-2004-3可能属于直立(er)区组或匍匐(p)区组。本研究所得4条序列均与花生区组的序列聚为一类,其中1-1、1-4与四粒红(3-3)关系相近

8、,而1-2与其关系较远,说明种间杂种既与母本有相似的地方,也与母本有一定的差异,为杂种的真实性提供了分子水平证据。3参考文献1 krapovickas a.the origin,variability and spread of the groundnut(arachishypogaea)(english translation)m.london:p.j.ucko and i.s.falk(eds.),1969.2 krapovickas a,gregory w c.taxonomy of the genus arachis (leguminosae)j.bonplandia,2007(16)

9、:1-18.3 汪小全,洪德元.植物分子系统学近五年的研究进展概况j.植物分类学报,1997,35(5):465-480.4 hamby r k,zimmer e a.ribosomal rna as a phylogenetic tool in plant systematicsmsoltis p s,soltis d e,doyle j j,et al.molecular sys-tematics of plants.new york:chapman &hall;,1992.5 prine g m.perennial peanuts for foragej.soil crop sc

10、i. soc. fla.proc.,1973(32):33-35.6 顾红雅.限制性片段长度多态性(rfl ps)在植物系统与进行研究中的应用m陈家宽,杨继.植物进化生物学.武汉:武汉大学出版社,1994:209-231.7 second g,wang z y.mitochondrial dna rfl p in genus oryz a and cultivated ricej.genet resour crop evol.,1992(39):125-140.8 陈之端,汪小全,孙海英,等.马尾树科的系统位置:来自rbcl 基因核苷酸序列的证据j.植物分类学报,1998,36(1):1-7.

11、9 olmstead r g,palmer j d.chloroplast dna systematics:a re-view of methods and data analysisj.amer j. bot.,1994(81):1205-1224.10 wolfe k h,li w h,sharp p m.rates of nucleotide substitution vary greatly among plant mitochondrial,choroplast,and nuclear dnasj.proc natl acad sci usa,1987(84):9054-9058.1

12、1 赵鸿,彭德良,朱建兰.rdna-its-pcr 技术在植物寄生线虫分子诊断中的应用j.植物检疫,2004,18(2):1-6.12 kollipara k p,singh r j,hymowitz t.phylogenetic and genomic relationships in the genus glycine willd.based on sequences from the its region of nuclear rdnaj.genome,1997(40):57-68.13 ainouche m l,bayer r j.on the origins of the tetra

13、ploid bro-mus species(section b romus,poaceae):insights from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal dnaj.genome,1997(5):730-743.14 张文驹.应用rdna的its区探讨多倍体小麦的基因组起源d.武汉:武汉大学,1998.15 kim k j,jansen r k.comparisons of phylogenetichypotheses among different data sets in dwarf dandelions(

14、krigia):additional information from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal dnaj.plant syst. evol.,1994(3-4):157-185.16 sang t,crawford d j,kim s c,et al.radiation of the endemic genus dendroseris(asteraceae)on the juan fernandez islands:evidence from sequences of the its regions of nuclear ribosomal dnaj.amer j. bot.,1994(81):1494-1501.17 wendel j f,schnabel a s,seelanan t.bidirectional interlo-cus concerted evolution following allopolyploidspeciation in cotton(gossy