小鹅瘟病毒实验室检测方法研究进展

1、    小鹅瘟病毒实验室检测方法研究进展    庄金秋+梅建国+莫玲+姚春阳+沈志强：s858.335.3      ：a      ：1673-1085（2014）05-0040-05小鹅瘟（gosling plague，gp）又称为鹅细小病毒病，是由细小病毒科细小病毒属的鹅细小病毒 （goose parvovirus，gpv）引起的一种急性或亚急性、高度接触性、败血性传染病。该病主要以严重下痢、渗出性肠炎和肠道栓塞为特征。发病雏鹅常表现为出血性、纤维素性及渗出性肠炎，最后形成肠内栓塞。该病主

2、要发生于1月龄以内雏鹅和雏番鸭，具有传播快、发病率和死亡率高的特点，死亡率可高达90%以上。随着雏鹅日龄的增长，其发病率和死亡率呈下降趋势。我国学者方定一于1956年首次报道该病，并成功分离到gpv。该病长期以来在我国乃至全世界鹅群中广泛流行，是目前危害养鹅业的主要传染病之一，常给养鹅业造成严重的经济损失。一般认为，小鹅瘟根据流行病学、临床特征和剖检特点，可以做出初步诊断，但是确诊本病需要进行实验室诊断。本病暴发的主要原因是呈亚临床感染或隐性感染者的鹅排毒污染种蛋及环境，从而将病毒传给易感雏鹅。因此，做好该病的预防控制，特别是快速而准确的诊断方法的建立受到国内外学者的广泛关注。本文就我国在gp

3、v检测技术研究进展方面作一综述，以期对小鹅瘟的深入研究和疾病防控提供参考。1  病毒分离鉴定gpv能在鹅胚、番鸭胚或其原代细胞培养物以及marc-145细胞中增殖并形成细胞病变（cpe），但不能在pk15和cef等细胞中生长。将病料接种在未长满单层的鹅胚或番鸭胚原代细胞培养物中，随着传代次数的增加，细胞单层感染病毒后35d出现明显cpe，表现为细胞折光性增强、圆缩直至溶解脱落等。将细胞培养物经苏木素-伊红染色后可见cowdrya型核内包涵体与合胞体的存在1。将收集的死亡鹅胚、番鸭胚尿囊液或细胞培养物经磷钨酸负染后进行电镜观察，根据病毒大小、形态等典型的细小病毒特征可进行鉴定。2 &#

4、160;血清学检测2.1  酶联免疫吸附试验（elisa）  朱少璇等2（1989）应用抗gpv单抗对鹅胚初次分离毒用间接elisa法进行鉴定。李永峰3（2010）以纯化的gpv重组vp3蛋白为包被抗原，建立了检测雏番鸭水禽细小病毒抗体的间接elisa方法，经初步应用于血清中水禽细小病毒抗体的检测，其敏感性高于琼脂扩散试验，与中和试验结果基本一致，符合率为84%。尚绪增等4（2010）也建立了检测gpv的间接elisa方法，表达了gpv重组ns2蛋白。秦爱建等5（1990）建立了gpv单抗免疫酶斑点试验，对提纯gpv最小检出病毒蛋白量为0.17ng/ml。李新华6（1998

5、）应用辣根过氧化物酶（hrp）标记单抗对gpv强毒致死的雏鹅和番鸭的组织匀浆上清液进行了斑点酶联免疫吸附试验，其敏感度达到8.5ng/ml，检测时间3h，非常适用于大批量样品的快速检测。廖德惠等7（1994）用纯化的gpv抗原，制备兔抗gpv血清，应用斑点酶联免疫吸附试验（dot-elisa）能检出少至4.883ng/mg的gpv抗原。龚建森等8（2008）建立了双抗体夹心elisa方法检测gpv。布日额等9（2009）利用 gpv vp1vp3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原，建立了检测鹅抗体的elisa和dot-elisa方法，并对弱毒疫苗的免疫效果进行了检测，两种方法的检测结果基本一

6、致。杜秋明等10（2011）建立了检测gpv的单抗双夹心elisa方法，对gpv检测灵敏度达0.312mg/l。用该法对延边某养鹅场疑似发生小鹅瘟病的252只病死鹅进行检测，结果阳性率为75.79%，与病毒中和试验方法的检测结果符合率达91.11%，为gpv的检测和区域流行病学调查提供了一种简便快速的血清学方法。三种elisa方法进行比较发现，能够直接检测病料的是斑点酶联免疫吸附，而间接elisa和双抗体夹心elisa检测需要对病毒进行分离，病毒分离至少需要5d，有的甚至初次分离不出病毒，需要连续传代23次，试验时间较长，不能满足临床快速诊断小鹅瘟的需要。邹叔和等11（1992）报道了用生物素

7、-亲和素（abc）系统的复合物-酶联免疫吸附试验（abc-elisa）检测gpv的研究，其对提纯的gpv dna最小检出量为0.1g，该方法很敏感，但操作繁琐且复杂。2.2  琼脂免疫扩散试验（agp）  agp方法操作简便、经典快速，适于基层推广和应用，但灵敏度不高，需要高效价抗血清及多倍浓缩的尿囊液进行gpv的检测。李侯宝等12（1987）、余永建等13（1987）、洪锋等14（1989）、王新海15（1990）、秦爱建等16（1993）、汤明等17（1994）、霍峰等18（2000）先后报道了应用agp检测gpv的研究。陈天祥19（1990）报道了应用该方法检测gpv

8、卵黄抗体水平的研究。agp方法非常适用于gpv感染的临床诊断及免疫鹅抗体水平的监测。2.3  反向间接血凝试验  徐为燕等20（1981）、孙怀昌等21（1989）建立了反向间接血凝试验的方法检测鹅胚尿囊液中的gpv。郭玉璞等22（1994）对此法做了进一步完善，对病料中gpv的检测灵敏度能达到24ng/ml。人工感染的鹅胚尿囊液、人工感染发病鹅肝组织及其粪样中的gpv检出率分别为100%、81%和99%。该方法对小鹅瘟可疑病例3h内即可做出诊断，有很好的实用价值，但敏感性差，易受到非特异性因素的影响，降低试验的准确性。2.4  胶乳凝集试验（lap）  

9、;朱小丽等23（2012）采用gpv单抗标记聚苯乙烯胶乳，建立了检测gpv抗原的lpa方法。对人工感染病例的lpa检测结果与pcr符合率为93.3%;对临床18份疑似gpv病例进行检测，lpa和pcr符合率为94.5%。表明lpa具有简便、快速、特异、准确等优点，适用于基层快速诊断小鹅瘟病。 2.5  病毒中和试验（vn）  gpv与相应的抗体结合后，会失去对易感鹅的致病力。此方法可在鹅胚及其成纤维细胞上进行。赵坤等24（2000）、张耀成等25（2001）以鹅胚及其成纤维细胞建立此法检测gpv抗原，结果不仅重复性好，敏感性高，还易于操作，但检测时间较长，不适于大量病料组织

10、的快速检测。2.6  免疫荧光（if）抗体技术  潘玉民等26（1990）应用gpv高免鹅血清提取igg标记异硫氰酸荧光素（fitc）建立直接免疫荧光法用于检测鹅体内的gpv抗原，该方法可直接检出病料组织中的gpv，但不能克服番鸭细小病毒（mpv）与gpv在血清学上的交叉性。邱平等27（1996）也有报道应用fitc标记抗鹅源gpv的特异性单抗，建立免疫荧光技术检测鹅源gpv，该方法敏感性好，检出率较高，2h内可检测出gpv抗原。郑大恒等28（2003）用兔抗gpv高免血清，提取igg标记fitc建立直接免疫荧光法用于检测鹅体内的gpv抗原，该方法虽然简便快捷，但仍不能区分

11、mpv和gpv。朱小丽等29（2012）将抗番鸭gpv单抗腹水采用透析法标记fitc，制备成抗gpv荧光抗体，研制了检测gpv抗原的直接免疫荧光方法。蔡羲等30（2009）用抗番鸭gpv杂交瘤细胞上清和单抗作为一抗，检测gpv取得良好的效果。吕雪峰等31（2012）利用制备的荧光抗体，建立了较为高效的检测gpv的直接免疫荧光法，表明其所制备出的鹅igg荧光抗体敏感性较高、特异性较强。郭卉等32（2013）建立了检测gpv的间接免疫荧光方法（ifa），该方法不仅能够检测鹅胚成纤维细胞中的gpv，还能够检测发病鹅组织冰冻切片中的gpv。为今后gpv细胞活疫苗的检测评价和临床诊断提供了技术手段。免疫

12、荧光抗体技术重复性和稳定性良好，具有较强的特异性和敏感性，而且操作简便、快速，但需要特殊的仪器，不适合基层推广。2.7  胶体金免疫层析（gica）技术  该方法是基于单克隆抗体建立的诊断技术。李长瑜等33（2007）报道了gpv胶体金层析检测卡的研究，虽然该方法的特异性强，灵敏度高，但是该方法需要对病原进行分离后，取鹅胚或者番鸭胚尿囊液或细胞培养物进行检测，病原分离和检测至少需要5d，不适合在临床上快速检测应用。2.8  对流免疫电泳技术  谢曼琳等34（1990）建立了检测gpv的对流免疫电泳试验方法，对gpv的检出率高达94.1%，整个过程只需3h

13、，比agp快4倍，有利于小鹅瘟的早期确诊。本方法虽然具有快速、敏感、特异性强等特点，但容易受到非特异性因素的影响，降低试验结果的准确性。3  分子生物学检测3.1  pcr技术  目前我国多家研究机构均建立了gpv的pcr快速检测方法，在临床小鹅瘟病例的诊断中取得了良好的效果。布日额等35（2003）、胡桂学等36（2003）、黄诚等37（2004）、姚笛等38（2006）、李福伟等39（2006）、刘家森等40（2007）、邵洪泽等41（2009）、李文学等42（2010）、王倩等43（2012）、赵磊等44（2013）建立了检测gpv的单重pcr方法，赵研等4

14、5（2007）、王暖成等46（2010）、王静雅47（2012）建立了双重套式pcr方法。董浩等48（2011）建立了能对石蜡切片中gpv核酸进行定位的原位pcr方法，为gpv在鹅体内的定位、致病机理研究等提供有效的试验手段。荧光定量pcr方法检测gpv具有更高的特异性和敏感性。毕建敏等49（2008）将real-time pcr成功应用于gpv的检测。龙朕等50（2010）、董浩等51（2011）建立了gpv的taq man荧光定量pcr检测方法。饶桂波52（2013）研究建立的pcr-dhplc检测方法阳性检出率达100%，是一种新的检测gpv的方法。该方法能够特异性检测病料组织中gpv，

15、为临床gpv的感染提供了有效的检测手段。3.2  环介导等温扩增（lamp）技术  尚毅等53（2011）、金文杰等54（2012）建立了lamp技术应用于gpv的快速诊断，缩短了检测时间。傅秋玲等55（2013）针对gpv vp3基因的8个位点设计了6条特异性引物，也建立了快速检测gpv的lamp方法。该方法灵敏、特异、实用、快速，非常适合基层及现场快速检测。研究首次采用钙黄绿素代替sybr green染料作为gpv lamp检测方法的指示剂，解决了采用sybr green染料作为指示剂造成假阳性的技术难题，使得lamp方法在临床检验上具有更广阔的应用前景，为临床检测提供

16、了一种新方法。3.3  核酸探针技术  核酸探针技术是一种极其敏感的分子生物学方法，具有pg水平的检测灵敏度。该方法检测gpv不仅仅快速、准确、操作简便、成本低，还可反复长期使用，从根本上减少甚至避免了抗原的多样性和易变性而引起的交叉反应和非特异性反应。段玉友等56（1993）、余兵等57（2002）、布日额等58，59（2004和2005）以地高辛标记成核酸探针，并运用该探针初步建立了检测病料中gpv核酸的斑点杂交法。该方法特异性、敏感性和适用性都很强，但其技术性要求较强，操作繁琐，且检测成本较高，不适宜临床上的推广与应用。4  存在的问题与展望小鹅瘟是危害养禽

17、业的重要传染病，一旦发病将造成巨大的经济损失。因此，建立快速、敏感、特异的gpv检测方法，加强该病的流行监测，掌握该病的流行趋势及该病毒分子遗传变异的规律，是该病临床诊断、防疫与检疫的迫切要求，将有助于降低该病在家禽的流行，并促进研制有效防控该病的疫苗。目前针对该病毒已建立了多种检测方法，这些方法的使用极大地方便了该病的及早诊断，使得疫情得以有效控制。然而这些方法各自存在不同的优缺点或苛刻要求，如有的存在操作繁琐、受检测材料限制，有的试验周期较长，有的对试验仪器及检测人员技术要求高等，这就需要实验室检测人员根据各自条件，综合选择并建立合适的检测方法，及时、准确、快速地监测疾病的发生、发展和流行

18、，并提供有效的防控措施。另外，随着分子生物学的发展和人们对gpv研究的不断深入，相信不久的将来，更多更为高效、敏感、特异、快速、简易而且价廉的检测方法将会被建立起来。 参考文献：1  kontrimavichus lm，makogon vr and navrotkii vv. epidemiological， clinical and pathological features of goose viral enteritisj. vet moscow，1980，7：34-35.2  朱少璇，董国雄.抗小鹅瘟病毒单克隆抗体及其在防治上的初步应用j.江苏农学院学报，1989，

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