(完整word版)基因工程期末复习2

1、1 生物技术：（biotechnology ）,是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科 学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的2、生物技术的核心：生物技术是现代生物学发展及其与相关学科交差融和的产物，其核心 是以 DNA重组技术为中心的基因工程，还包括微生物工程、生化工程、细胞工程及生物制 品等领域3、 基因工程：（genetic engineering ）又称基因拼接技术和DNA 重组技术，在体外把核酸分子插入载体分子，构成重组DNA，引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种

2、（品系） 。2.基因工程概念的发展：遗传工程TDNA 重组技术T分子/基因克隆（Molecular/Gene 宀基因 工程T基因操作。应用领域以“基因工程”、“DNA 重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973: Boyer 和 Cohen 建立 DNA 重组技术1978: Gen etech 公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市 1988 : PCR 技术诞生1989 :我国第一个基因工程药物rhIFN a 1b 上市2003:世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53 上市3.基因工程的三大关键兀件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源

3、基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA 分子。宿主（受体）：，能摄取外源 DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。5、基因工程的目的:产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。6、基因工程的特征：1）跨物种性：外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。2）无性扩增：外源 DNA 在宿主细胞内可大量扩增和高水平表达。7、 基因工程研究的理论依据：不同基因具有相同的遗传物质基础。基因是可以切割的。基因是可以转移的。多肽与基因之间存在着对应关系。遗传密码是通用的 。基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。8 试述基因工程的主要研究内容 。1）、目的基因的分离 2）、DNA 的

4、体外重组（载体、受 体系统等）3）、重组 DNA 分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、 表达、检测及其分析。9、基因工程的技术路线：一、取得符合人们要求的DNA 片段，这种 DNA 片段被称为 目的基因”；:、构建基因的表达载体；三、将目的基因导入受体细胞；四、目的基因的检测与鉴定。4.基因工程的基本步骤（1） 目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR 扩增等步骤，分离出 带有目的基因的 DNA 片断。（2） 重组体的制备：将目的基因的 DNA 片断插入到能自我复制并带有选择性标记的载体 分子上。（3） 重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中

5、。（4）克隆鉴定：挑选转 化成功的细胞克隆。（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物10、基因工程的的发展史：基因工程诞生的理论基础是什么？ 是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。（1）理论上的三大发现：1证实了 DNA 是遗传物质2揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理遗传密码的破译和遗传信息传（2）递方式的确定 技术上的三大发明：限制核酸内切酶的发现与DNA 切割DNA 连接酶的发现与 DNA 片段的连接 基因工程载体的研究与应用11、 RNA 的类别（1）信使 RNA:起着传递遗传信息的作用（2）核糖体RNA : 一般与核糖体

6、蛋白质结合在一起，形成核糖体。可能有助于mRNA 与核糖体的结合（3） 转移 RNA:把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA 能根据 mRNA 的遗传密码依次准确地将 它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。12、 原核生物 MRNA 结构的特点：单顺反子：只编码一个蛋白质的mRNA;多顺反子：编 码多个蛋白质的 mRAN。13、 原核生物基因结构的特点： 为一条环状双链 DNA :只有一个复制起点；具有操 纵子结构；绝大部分为单拷贝；可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒；基因 一般是连续的，无内含子；重复序列很少。14、 真核生物 mRNA 的结构特点：内含子：不编码蛋白质的基因序列；外显子：编码蛋

7、白 质的序列15、 真核生物基因结构的特点：（）真核基因组结构庞大（二）单顺反子（三）重复序列（四）基因不连续性16、 中心法则（Central dogma of molecular biology ）:从 DNA 流向 DNA （ DNA 自我复 制） ；从 DNA 流向 RNA,进而流向蛋白质（转录和翻译） ；从 RNA 流向 RNA （ RNA 自 我复制）；从 RNA 流向 DNA （逆转录） 注：其中前两条是中心法则的主要体现，后两条是中心法则的完善和补充17、 信号肽（Signal peptide）:常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N- 末端的氨基酸序列18、

8、基因工程的工具酶一一限制性内切酶：限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？酶的纯度。 DNA 样品的纯度。 DNA 的甲基化程度。 酶切反应的温度与时间。DNA 分子的构型。 限制性核酸内切酶的反应缓冲液。19、 宿主细胞 受体细胞（host cel）:接受移植物的细胞和在基因工程技术中接受DNA 重组体并为重组体进行扩增（克隆）提供原料、条件和场所的细胞，20、 宿主细胞 受体细胞的选择原则：易于接纳外源 DNA :无特异的内源核酸内切酶；3载体复制、扩增不受阻；与载体有互补性。或1.限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷 2.重组整合缺陷型 一一用于基因扩增或高效表达的受体细胞 3.具有较高的

9、转 化效率 4.具有与载体选择标记互补的表型 5.感染寄生缺陷型一一防止重组细菌扩散污染， 生物武器除外。21、大肠杆菌受体系统的特点：大肠杆菌作为基因工程受体菌的优点和缺点是什么？大肠杆菌表达系统的优点1遗传背景清楚，便于基因操作2表达水平高，遗传较稳定3优良的工业性能：繁殖迅速、培养简单、操作方便4.被美国 FDA 认定为安全的重组药物生产系统大肠杆菌表达系统的缺点1.缺乏翻译后修饰加工系统2胞内缺乏高效的表达产物折叠机制，分泌机制不完善周质内含有种类繁多的内毒素22、 载体(Vector):是把外源 DNA 导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具24、质粒(plasmid):是存在于细

10、胞中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。 分子克隆载体常用类型：3细胞质粒：15kb 以下lamda 噬菌体 DNA: 25kb细菌人工染色体(BAC):50-300kb,主要用于基因文库构建酵母人工染色体(YAC): 350-400kb，主要用于基因文库构建23、 启动子(promoter)： 一段能与 RNA 聚合酶结合并能起始 RNA 合成的 DNA 序列 组成型启动子，组织特异型启动子，诱导型启动子24、 SD 序列(Shine-Dalgarnosequence):位于翻译起始密码子上游的6-8 个核苷酸序列。在大肠杆菌 mRNA 的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16

11、S 核糖体 RNA 3 ,末端碱基互补的序列。25、 终止子(terminator T):是给予 RNA 聚合酶转录终止信号的DNA 序列。26、 起始密码子(initiation codonm): 信使核糖核酸分子中规定编码多肽链第一个氨基酸 的密码子。27、 TI 质粒(tumor-inducing):在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形 双链 DNA分子28、 T-DNA 区(transferred-DNA regions ):农杆菌侵染植物细胞时，从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移 DNA。32、 增强子：(Enhancer)位于结构基因附近，能

12、够增强该基因转录活性的一段DNA 顺序33、 沉默子：(Silencer)位于结构基因附近，能抑制该基因转录表达的DNA 序列34、 弱化子(attenuator) :RNA 合成终止时，起终止转录信号作用的那段DNA 序列37、操纵子(operon):指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称。36、 cDNA 文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而成的 克隆的集合。37、 Western 印迹：是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上；然后用特异性 的抗体进行检测；可说明基因是否进行了表达。28、 目的基因的制备：直接分离法、构建基因文库分

13、离法、PCR 扩增法、人工合成法等29、 载体 DNA 片段的制备：DNA 提取的几种方法.根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法生物方式：酶法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法DNA 提取的几种方法。根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法。浓盐法：利用 RNP 和 DNP 在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂抽提法：有机溶 剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物30、 重组子的选择与筛选鉴定： 重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以

14、分为如下几个类型：(1)基于载体遗传标记检测法在构建基因工程载体系统时，载体DNA 分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。(2 )基于克隆 DNA 序列检测法Southern 印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链 DNA 探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。（3）基于外源基因产物检测法如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的

15、克隆子。31、PCR 反应：PCR 反应体系包括哪些内容？基本反应过程是什么？PCR 反应体系所要求的条 件：a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA 引物（约 20 个碱基左右）。b、具有热稳定性的酶如： TagDNA 聚合酶。c、dNTP。d、作为模板 的目的 DNA 序列，E 无菌水，F,缓冲液PCR 反应体系的基本反应过程：预变性、变性、退火、延伸、复延伸。PCR 克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？主要原理：利用真核生物 mRNA 结尾处有 POLY（ A）结构，在其 3端设计象 5-T11GA 样 引物，该引物可与 mRNA 总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转

16、录，同时结合 5端的随机引物（20 条 10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。优点：简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA 的组成。 所需的 mRNA 量少。各样本 mRNA 的差异可同时进行比较。扩出的 cDNA 可直接用于测序、文库筛选等。缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。 无法定量研究。扩出的条带往往是 3端比较短的 UTR 区的一段序列，提供的信息较少。PCR 技术的特点：1）高度的灵敏性 2）特异性 引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定 PCR 反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时 尽可能减少非特异性扩增。

17、3）操作简便易行 4 ）用途广泛35、作为基因工程载体必须具备的基本条件是什么？能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制具有合适的限制内切酶位点具有合适的选择标记基因4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种；第二，延长食品保存时间或增加营养成分；第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护；第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。人们对转基因技术的主要担忧在于环境

18、方面。 外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性， 也即 转基因生物存在潜在的环境安全问题。转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10 亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可， 食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。 因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。6.分子杂交的类型主要有哪些？探针的标记方法与标记类型？常用的双链DNA 的标记方法是哪两种？探针的标记方法：切口平移法、随机引物合成法，末

19、端标记法，PCR 标记法，体外转录标记法。探针按核酸分子分：DNA 探针和 RNA 探针；按标记物的不同：放射性标记探针和非放射性标记探针。标记类型：按核酸分子的不同：可分为 DNA 探针和 RNA 探针根据标记物的不同： 可分放射性标记探针和非放射性标记探针；双链 DNA 探针标记主要方法：切口平移法、随机引物合成法7、外源基因是否表达，表达量如何？等）对转基因个体进行检测与鉴定的对象一一报告基因一一目的基因（1）基因组水平的检测与鉴定（外源基因是否整合，被插入位点分析）：可以用 PCR 扩增结合 Southern Blotting 进行验证。基因的转录/表达水平的检测与鉴定（外源基因是否表

20、达）:可用 RT-PCR 法或者Northern Blotting。基因的翻译水平的检测与鉴定（表达量）：可用 Western Blotting 或者 ELISA。对报告基因来讲，还可以利用报告基因的显色或发光特性进行选择与鉴定8 为了大量获得用于生化鉴定的产物，你想将小鼠中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在大肠杆菌中表达，怎样进行？你又如何确保最终能得到产物？由于基因已被测序，可通过RT-PCR 方法克隆该基因；也或通过基因文库分离法获得该基因；3基因可以在大肠杆菌中作为融合蛋白质或分泌蛋白质进行表达。具体操作如下：4制备目的基因；连接到T-载体；转化大肠杆菌，提质粒；测序；酶切，回收目

21、的基因，连接到原核表达载体；再转化大肠杆菌，大量培养；分离、纯化和检测表达产 物。分子杂交的基本方法? Southern 印迹法：DNA/DNA 杂交，即将 DNA 电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern 杂交（Southern bloting）的主要步骤?待测 DNA 样品的制备、酶切?待测 DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳？凝胶中 DNA 的变性：碱变性？Southern 转膜：a 硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜b 毛细管虹吸印迹法、 电转印法、真空转移法？探针的制备？Southern 杂交？杂交结果的检测Northern 印迹法：检测 RNA （主要是 m

22、RNA ）的方法与 Southern 杂交的不同：a）靶核酸：RNA,b）RNA 电泳,c）转膜：不需变性?斑点印迹杂交：将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于 NC 膜或尼龙膜上；优点：简单、快速、 可同时检测多个样品？原位杂交将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究；不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高；能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。Western 印迹法：检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法?液相杂交82. 探针的种类：cDNA 探针、基因组 DNA 探针、寡核苷酸探针、RNA 探针标记物：核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H 等非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等83. Sange