实验设计样本

1、机能学实验设计大纲实验名称 ：急性乙醇中毒大鼠学习记忆行为的改变与脑组织 no 含量变化课题来源 ：自选设计班级 ：2007 级临床本科九班设计人员 ：蔡林均设计日期 ：2010 年 3 月 30 日指导老师 ：张奇兰成都医学院实验技术教研室2009年制一、实验设计的目的意义：实验设计的目的意义，国内外研究现状，存在的问题，解决问题的思路。目的与意义: 通过观察急性乙醇中毒对大鼠学习记忆的影响并测定脑组织中一氧化氮 (no) 含量的变化，从而探讨乙醇中毒影响学习记忆的分子机制国内外研究现状：酒精中毒问题在西方国家发病率很高，已成为严重的社会问题，在我国，随着社会经济发展，生活水平的提高，近几年

2、来，酒精中毒的发病率也逐年上升，应引起全社会的高度重视酒中毒发病率在欧美较高，gcldcs 等报告大不列颠及北爱尔兰联合王国占住院病人总数的10% 左右，而法国、德国、爱尔兰大约接近30 % ，亦有人报告占初次住院病人总数的1.317.6 %，某些地区已高达20 一 30 %。而我国发病率较低，上海1993 年报告酒中毒性精神病占初次入院的0.075 %，2000 年 为 0.15 %，2005 年为 018 %。济南及淄博的报告分别为0.13 %和 0.24 %。由此可见普通人群的发病率正在逐年上升，个别地区已接近西方发达国家国内各家报告不一，上海报告发病年龄在21 一 72 岁，济南报告发

3、病年龄为 l565 岁 ，青岛及淄博的报告分别为2560 岁， 2564 岁。烟台则为2270 岁 。从上述资料看出酒中毒的发病年龄已从老年向中青年转化，说明饮滔年龄逐渐转缸低年龄，有的个别地区已接近国外报告。2000 年郝小娇等做了急性乙醇中毒大脑皮层氨基酸类递质的变化选大鼠30 只随机分为对照和模型组，采用高效液相色谱紫处法，测定脑中氨基酸的含量变化2006 年贾晓军，王艳芳等做了orexin a（神经肽）对乙醇中毒昏迷大鼠的促醒，首先建立实验模型，通过翻正反射判断大鼠的意识状态，并通过脑电波判断脑电活动变化可以更加深刻的了解乙醇中毒大鼠脑电活动变化2007 年谭春艳，张霞等做了慢性乙醇中

4、毒性周围神经病大鼠的氧化应激研究 ，建立实验模型后，在第8， 12，16 周分别测gsh (谷胱甘肽） gsh_px(谷胱甘肽过氧化物酶)，mda(丙二醛 ) ，并观察其变化，从而反映大鼠对乙醇损害的代偿性保护2008 年刘宝梅，陆洪英等，做了乙醇中毒脑干听觉诱发电位变化观察，将46 例乙醇中毒患者与46 例正常人进行baep(脑干听觉诱发电位)测定，并与正常受试者比较。观察其波潜伏期，波间期变化。了解乙醇中毒与大脑听觉区的机制2009 年颜红 ,做了乙醇中毒大鼠脑内内源性阿片肽系统含量变化，观察海马内源性阿片肽含量变化，并记录血中乙醇含量，乙醇对中枢神经系统的损害存在的问题 :李鑫等对 急性

5、乙醇中毒大鼠下丘脑神经递质及行为改变的相关研究观察乙醇中毒后，雄性大鼠下丘脑促性腺激素释放激素(gnrh) 神经元合成和释放激素功能及交配变化，以此来探讨急性乙醇中毒后大鼠行为改变的可能机制。并证实了，大鼠交配行为的改变可能与下丘脑gnrh 神经元的合成和分泌功能被制并引起血中睾酮水平相应降低有关。未能证明：摄入高浓度乙醇对下丘脑内gnrh 神经元合成和释放激素的功能有显著的抑制作用，但随着乙醇浓度降低，抑制作用逐渐减弱。其可能原因是乙醇阻断了gnrh 神经元终末端对no 的反应性， 使 gnrh 神经元合成和释放减少，但其具体机制尚不十分明确littleton 采用细胞外记录法在伏隔核片制备

6、上研究乙醇作用，探讨乙醇中毒的细胞机制。 证实了， 酗酒者常发生乙醇中毒性“ 记忆缺失 ” ，是与乙醇抑制海马中n一甲基一d 一天冬氨酸受体有关。未能证明：长期饮酒者脑内n 一甲基一d 一天冬氨酸受体密度增加的机制，猜测可能是乙醇对谷氨酸系统抑制后出现的代偿反应。解决问题的思路：动物分组与模型建立，y 一型迷宫检测学习记忆，用试剂盒对脑组织no 含量检测参考文献：1 keynes rg ，garthwaite jnitric oxide and its role in ischemic brain injuryjcurt mol med ，2004，4(2)：179 1912 刘惠卿，李文斌，

7、李清君，等脑缺血预处理对大鼠海马ca1 区一氧化氮合酶活性和一氧化氮含量的影响j中国病理生理杂志，2006，22(1)：88923 ponomarev i，crabbe jca novel method to assess initial sensitivity an d acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanoljj pharmacol exp ther ，2002，302(1)：2572634 lynch ma long term potentiation and memoryj physiol rev，2004，84

8、(1)：87 136二、实验设计方案（实验设计目标,拟解决的主要问题, 实验动物设计 ,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排） 。（一）实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标：通过观察急性乙醇中毒对大鼠学习记忆的影响并测定脑组织中一氧化氮 (no)与神经型一氧化氮合酶(nnos)含量的变化，探讨乙醇中毒影响学习记忆的分子机制，本实验利用y 一迷宫实验进一步证实了急性乙醇中毒可对大鼠学习记忆能力产生负面效应，说明乙醇的神经毒性作用能明显抑制实验大鼠的学习记忆能力， no 在长时程增强效应(ltp)、长时程突触传导抑制(ltd) 的产生中都起作用，参

9、与了学习和记忆的过程。但当机体受到过度刺激时，会诱导no 的大量产生，从而对神经细胞产生毒性作用。从而借此作为推测对人的影响拟解决的关键问题：实验模型的制备。 对急性乙醇中毒的模型进行分组与实验结果分析。（二）实验设计1、 实验动物设计a)我们选用大鼠作为实验动物，有以下几点理由：b)1） 、大鼠易得到，容易饲养，在科研工作中被广泛利用c)2） 、大鼠易于得到样品，能在称重过程中减少实验误差。2、 实验专业设计选用大鼠作为实验动物，模型组大鼠腹腔注射(ip) 乙醇 25 gkg用生理盐水配成含 20 乙醇 (wv) 的溶液 ，5 min 时翻正反射消失的为模型成功，对照组大鼠腹腔注射等体积生理

10、盐水。观察指标：一般行为观察，学习记忆成绩，脑组织no 含量检测。3、 实验统计设计实验统计设计中应始终贯彻随机、对照、重复三大原则。（ 1）随机：成年健康雄性大鼠34 只，体重200250 g。适应性饲养2 d 后开始实验随机分为对照组 (16 只)和模型组 (即急性乙醇中毒组，18 只) （ 2）对照：本组实验做了空白对照和实验对照。（ 3）重复：本实验采用的是随机分为组，具有一定的重复性。（ 4）统计数据收集分析：实验组对照组脑组织no 含量学习记忆成绩一般行为观察本实验采用计量资料来测定各种指标的数值，所有数据均采用（平均数 标准差 s）表示，以0.05 作为显著性检验水准。1）建立检

11、验假设h0：u1= u2（各脑组织no 含量，学习记忆成绩无差异）。h1：u1、u2 不等或不全相等， 0.05。2）计算统计量利用统计学专业软件spss做 one-way anova 。3)查 t 值表，确定p 值，得出结论。4、实验方法设计4.1实验技术路线4.2实验技术方法1. 实验分组： 成年健康雄性大鼠38 只，体重 200250 g。适应性饲养2 d 后开始实验。随机分为对照组(16 只)和模型组 (即急性乙醇中毒组，18 只)。2. 实验手术：y 一型迷宫检测学习记忆模型制备后6 h，将大鼠置于迷宫中，将3 条臂的指示灯均打开，让其适应环境，3 min 后将灯熄灭。随机打开其中1

12、 臂的指示灯，不亮的 2 臂自动延迟5 s后则通电电击大鼠，直至逃避到安全区为止，然后灯亮持续15 s 后熄灭，完成1 次测试。大鼠在10 s 内 1 次直接逃至安全区为正确反应，否则为错误反应。以1o 次电刺激后有9 次做出正确反应为学会，用大鼠学会所需训练的次数来表示其空间分辩反应的学习记忆成绩。所有学习记忆测试均于晚间安静、暗光下进行。记忆功能检测时，对电刺激反应迟钝的大鼠予以剔除(模型组大鼠 1 只不符合实验条件剔除，剩余17 只)。3. 脑组织 no 含量检测学习记忆测试完成后，从 2 组大鼠中分别随机抽取8 只大鼠断头取脑， 采用硝大鼠2 组实验组1 组对照组注射生理盐水注射乙醇y

13、 型迷宫y 型迷宫断头取脑测no 断头取脑测no 酸还原酶法检测海马及纹状体组织匀浆的no 含量，检测方法按试剂盒说明书的步骤操作4. 模型复制： 模型组大鼠腹腔注射(ip)乙醇 2 5 g kg用生理盐水配成含20乙醇 (wv) 的溶液 ，5 min 时翻正反射消失的为模型成功（三）可行性分析: 1、大鼠易得到，容易侍养，在科研工作中被广泛利用。2、迷宫可以自己制作，用硝酸还原酶法检测no 含量，需要一个试剂盒。3、手术器材和设备均为实验室常用，手术方法我们也相对熟练。（四）预期效果:1一般行为观察模型组动物ip 乙醇 5 min 后翻正反射消失，1o 一 15 min 后清醒， 翻正反射恢复，行走、竖立、理毛等活动行为增多。对照组动物未见1 例出现翻正反射消失、蹒跚步态等共济失调的表现，注射生理盐水前后行为无明显变化。2学习记忆成绩达到学会标准