胶体金标记实验步骤

1、胶体金标记实验步骤点击次数：13发表于：2008-08-19 14:02转载请注明來自丁香园來源：丁香园1、蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋口的吸附主要取决丁- ph值，在接近蛋口质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢i古i的结 合物。如果胶体金的ph值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大 小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。（1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005mol/l ph7.0 nad溶液中4°c透析过夜，以除 去多余的盐离子，然后100 000g4°c离心1h,去除聚合物。（2）待

2、标胶体金溶液的准备以0.1mol/l k2co3或0.1mol/l hci调胶体金液的ph值。标记igg时， 调至9.0；标记mcab时，调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记spa时，调至5.96.2； 标记cona时，调至8.0；标记亲和索时，调至910.由于胶体金溶液可能损坏ph计的电板，因此，在调节ph时，采用精密ph试纸测定为宜。由丁盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必 须注意，蛋口质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离了和硼酸根离了的存在，因为它们都可吸附于颗粒表ifli而

3、减翦胶体金对蛋h质 的吸附。2. 蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定（1）根据待标记蛋白的要求,将胶体金调好ph之后,分装10管,每管1ml.（2）将标记蛋白（以igg为例）以0.005mol/lph9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5pg/ml-50pg/mi,分别取1ml,加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1 ml稀释液。（3 ） 5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%naci溶液，混匀后静置2h,观察结果。（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的 聚沉现象；而加入蛋白虽达到或超过最低稳定虽的各管仍保持红色不变。

4、以稳定1 ml胶体金溶液红色不变 的最低蛋口质用量，即为该标记蛋h质的最低用量，在实际丁作小，可适当增加1 0%20%。将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml（禽蛋白质540ug）加到1 ml胶体金溶液屮，另 设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0,1ml 10%naci溶液，混匀厉静置2小时，不稳定的金溶胶 将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋口量再加10%即为最佳标记蛋白量。3、标记：胶体金与蛋白质（igg）的结合将胶体金和igg溶液分别以0.1mol/l k2co3调ph至9.0,电磁搅样igg溶液，加入胶体金溶液，继 续搅样10min,加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋h与胶

5、体金聚介发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血淸（bsa）和1%聚乙二醇（分子量20kd）。加入的量：5%bsa使溶液终浓度为1 %； 1%聚乙二醉加至 总溶液的1 /10.在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附 量蚁大。下述标记步骤最为常见： 用0、1mol/l k2co3或0.1mol/l hci调节金溶胶至所需ph（标记s p a时调到ph6.0）。 于100ml金溶胶中加入最佳标记量的蛋h质溶液（休积为23ml）,搅拌23分钟。 加入5m i 1 %peg20000溶液。 于10000100000g离心3060分钟（根据粒径大小选择不同离

6、心条件），小心吸去上清液（切忌 倾倒）。 将沉淀悬浮于一定体积含0.20.5mg/ml peg20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复, 浓度以a1cm/540nm=1.5左右为宜，以0.5mg/mi叠氮钠防腐，置4°c保存。 包被后的金溶胶也可浓缩后于sephadex g-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1 % b s a的缓冲 溶液洗脱。通常用igg包被的金溶胶洗脱液ph为8.2,以a蛋白包被的金溶胶洗脱液为ph7.0.以上操作中应注意，一切溶液屮不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。4、胶体金标记蛋白的纯化（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋

7、h的利啖及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时 间。用bsa做稳定剂的胶体金一羊抗兔igg结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min, 5nm金胶 粒丿u 1 800r/min） 20min,弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物）|j 6 000g, 4°c离心1h； 20 nm40nm胶体金结合物，14 000g, 4°c离心1h.仔细吸出上淸，沉淀物用含1 %bsa的pb液（含0. 02%nan3）,将沉淀重悬为原体积的1 /10, 4°c保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18°c保存 一年以上。为了得到颗粒均一的免疫金试剂

8、，可将上述初步纯化的结合物再进一步用1 0%30%蔗糖或什油进行密 度梯度离心，分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。（2）凝胶过滤法：此法只适用于以bsa作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化°将胶体金蛋白结合物装入 透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1 /51 /10.再经1 500r/min离心20min.取上消加至sepha cryl s-400 （丙烯葡聚糖凝胶s-400）层析柱分別纯化。层析柱为0.8 cm x 20cm,加样量为床体枳的1 / 10,以 0.02mol/l pbs 液洗脱（内含 0.1 %bsa, 0.05%nan3, ph&2 者用 igg 标记物

9、），流速为8ml/h.按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，仃时略混浊，内含人颗粒聚合物等杂质。继z为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的増加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标 记的蛋口组分。将纯化的胶体金蛋口结合物过滤除菌、分装，4°c保存。最终可得到70%80%的产量。5、胶体金蛋白结合物的质量鉴定（1 ）胶体金颗粒平均直径的测昼用支持膜的繚网（铜网也可）離取金标蛋白试剂，自然于燥后直接在透 射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。（2）胶体金溶液的od520nm值测定：胶体金颗粒在波长51 onm550nm z间出现故大吸收值峰。 ffl0.02mol/lph8.2 pbs 液（含 1%bsa, 0.02%nan3）将胶体金蛋白试剂作 1 ： 20 稀禅，od520 =0.25左右。一般应用液的od520应为0.20.4。（3）金标记