酵母展示系统Fc诱导展示实验步骤

1、诱导培养基配制 selective scfv (or fab or ligand) induction medialx (sg-caa)成分：5 g/l casamino acids (-ade,ra, -trp) (bd bacto #223050)1 g/l galactose1 g/l raffinose (棉子糖是自然界中最知名的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成)0.05 g/l glucose7g/l ynb yeast nitrogen base with ammonium sulfate w/out amino acids (bd difco233520)2.7 g/l

2、na2hpo43.7 g/l nah2po4配制方法：10x 10%半乳糖称取loog溶于1000ml水屮推荐过滤除菌高压灭菌10x 10%棉子糖 称取100g溶于1000ml水中将 推荐过滤，高压灭菌即可20%葡萄糖 称取200g溶于1000ml水中 推荐过滤除菌，根据经验，高压灭菌即可10x 10%半乳糖10x ynb 称取70g溶于1000ml水中过滤除菌ix sg - caa 称取5g酪蛋口水解物2.7 g na2hpo4(6.8g na2hpq4.12h2o)3.7g nah2po4(4.8. nah2po4.2h2o) 加入500ml水中，定容至700ml高压灭菌 加入10x 10

3、%半乳糖100mk 10x 10%棉子糖100ml、20%葡萄糖2.5ml、10x ynb 100ml 混匀4度保存。有效期为1-2个月抗体诱导展示实验步骤:对照设:pyd说明书参考对照设置:controltype of controlpurposeeby100/pydlpositiveexpression and detection of the aga2 fusion protein demonstrates that the system is working properly.eby 100negativecontrols for background resulting from t

4、he cellseby 100/pyd 1 + gene of interest (uninduced)negativecontrols for leaky expression. (this will be the zero time point for the induction time course on page 10)可选对照：ebyloo/pyd-fv不诱导（阴性对照）步骤：1 挑单克隆至10ml sd-caa （葡萄糖生长培养基）中，250rpm, 30°c,摇过夜。2. 第二天测菌液浓度，od600应在25之间。如果小丁边，继续培养至od600=2-5,或直接进行步

5、骤3如果大于5,进行步骤3注：通常od600<2,展示抗体的细胞数将减少，od600v5,诱导展示抗体的时 间将延长3. 3000-5000 x g 室温离心 5-10mino4. 用sg-caa （半乳糖诱导培养基）重悬至od600= 1,以保证细胞继续处于对数 生长期，例：如果od600=2,则重悬在20 sg-caa培养基中。5立刻取出20d600的细胞，作为诱导起始点样木（oh） 例：od600=1,应取4mlo6.250卬m, 20°c,诱导培养。通常20°c会有更多的细胞展示抗体。7.每隔12h取一次样，直到第48h （ie:0h,12h,24h,36h,48h）以确定最佳诱导时间。 （取出的细胞4度保存，不要冻存细胞）表达检测1. 各个时间点收集的细胞3000-5000 x g , 4°c离心5-10mino2. 用1xpbs重悬，再离心3. 收集细胞，用 250ul 1xpbs, 1 mg/ml bsa, and 1 ug antibody 重悬混匀4. 冰上放置30min,期间混匀几次5. 3000-5000 x g