产纤维素酶细菌的筛选及培养

1、产纤维素酶细菌的筛选及培养一、筛选步骤1、菌种的采集采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成 粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀 静置。2、菌种初筛(1) 按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL 试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试 管包扎成一捆；取 12 套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无 菌水121C高压蒸汽灭菌20min。(2) 于无菌台上倒9个CMC培养基备用。(3) 另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液(上清 液)1.000mL加入1号试管，加无菌水

2、9.000mL。混匀后吸取1.000mL 加入 2 号试管，重复上述操作，进行 6 次梯度稀释。(4) 待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取 104、105、106 倍稀释液0.100mL于CMC培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。(5) 将上述培养基置于37C培养箱中培养24小时，标记菌落并 记录各菌落形态(菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及 表面纹理等)。(6) 配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起 121 C灭菌 20min。（7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。（8） 将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37C 培养24h,挑选5株透明圈直

3、径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复 筛。3、菌种复筛（1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中， 121 C高压蒸汽灭菌20min。（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环）， 37C、150r/min下培养23天，转入4C冰箱保藏。二、培养方法1清洗实验器具2 灭菌3 配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基）4倒平板+选择培养原菌（可能会用摇床）5稀释菌样6涂布平板或平板划线7 放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h，之后就可以收获 细菌了8 观察记录（数量、分布等）三、培养基种类及其组成1、初筛CMC培养基：CMC5g、蛋白胨 1 g、FeSO4-

4、7H2O0.005 g、NaCI 0.25 g、琼脂粉10g于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL调节pH 7. 27. 6,加棉塞121C灭菌20min。刚果红培养基：（NH4）2S04 2 g，MgS04- 7H20 0.5 g，K2HP04 1 g, NaCI 0.5 g，微晶纤维素2 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL。无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加水1000mL加棉塞与CMC培 养基一起灭菌20 min。另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和 12 套培养皿灭菌备用。2、复筛基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KHPO19, MgSO40. 29，Nacl 10g 水 1000mL pH调至 7，121C灭菌 20min3、培养纤维素培养基 :硫酸铵 2.0g ，硫酸镁 0.5g ，磷酸二氢钾 1.0g ，氯化 钠0