半定量RT-PCR

1、逆转录PCRRT-PCR为反转录 RCR reverse transcription PCR 和实时 PCRreal time PCR 共同的缩写。逆转录 PCR或者称反转录 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR, 一条 RN削被逆转录成为互补DNA再以此为模板通过PCRS行DNAT增。逆转录PCR由一条 RNA 单链转录为互补 DNA (cDNA)称作逆转录”，由依赖 RNA的DNA 聚合酶(逆转录酶)来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核昔酸引物和依赖RNA的DNA聚合酶完成，随每个循

2、环倍增，即通常的PCR。原先的 RNA模板被RNA酶H降解，留下互补 DNA 。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。(检测基因表达的方法，参见 Northern Blot 法。)RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作 定量 PCR (quantitative PCR) 或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR) 。实时PCR实时 PCR(real-time PCR)，属于定量 PCR (

3、Q-PCR )的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针(probe )。real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的 RNA来找出特 定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为定量 RT-PCR (quantitative RT-PCR )"RT-PCR技术相关试剂oligo:多聚体，相当于 mRNA引

4、物AMV (M-MLV ):逆转录酶dNTP :脱氧核昔酸RNase : RNA酶抑制剂PCR Buffer : RT-PCR 缓冲液MgCl2 : 2价镁离子PCR各步骤的目的（一）预变性：使DNA充分变性，减少DNA复特别是对于基因组来源的DNATaq酶的反应中，还可激活破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。杂结构对扩增的影响， 以利于引物更好的和模板结合, 模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动 Taq酶，从而使 PCR反应得以顺利进行。（二）变性-退火-延伸循环： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93 C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链 DN

5、A解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 C左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸： DNA模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA链互补的半保留复制链。（三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟用PCR仪扩增时，（变性.退火，延伸）循环完成后，继续72度延伸了 10分钟的原因：1. 延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用 taqDNA

6、聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s ,因此延伸速率为1kb/min 。2. 根据延伸速率推得， 扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min , 依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使 pcr反 应完全以提局扩增产量。3. 继续72度延伸了 10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。什么是半定量PCR半定量反转录一聚合酶链反应( semi-quantitative reverse transcription a

7、nd polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR )是近年来常用的一种简捷、 特异的定量 RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产 物的数量，可以推测样品中特异 mRNA的相对数量。以半定量 RT-PCR为基础建 立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法 更为简便可行。这种方法不另设 内标准'，排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵 敏读差异，而且具有明显的剂量-效益关系和良好的重复性。步骤：1.抽提RNA,2.反转录获得cDNA , 3.以cDNA为模板做PCR注意：步骤1, RNA

8、抽提质量一 定要好，注意污染。内参的选择，常用的有 6 actin和GAPDH俩中。步骤3,半定 量RT-PCR应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便丁控制，做图的 时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸活楚！半定辛RT-PCR与荧光定量Real-time PCR 最大的区别就在丁 semi-PCR需要跑电泳 根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低 或者是表达量的高低 而 Real-Time PCR则无需电泳 可以实时监测整个PCR的全程 并且由给出的Ct值 及Standard Curve 来判断gene拷贝数的高低。所以由上可见semi-PCR不如Real-Time P

9、CR 精确。至于 RT 应该指 Reverse Transcription 。为了便丁区分我们更偏好使用qPCR来特指Real-Time PCR同时要注意REALTIME-PCR 的定性问题，有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。所以要利用MELTING CURVE，如果是第一次做一个目的基因的REALTIME-PCR，还是要在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定与你要扩增的目的基因大小一致。RT-pcr只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量。而realtime-pcr的结果直接可以看到初始模板的量。所以， realitime-pcr更精确些。半定量RT-PCR电泳图如何分析半定量RT-PCR参照的做法一般有两种：1）将要比较的两个样品的 BETA-ACTIN 调成一样的亮度，然后就可以直接比较目的基因 的亮度了。方法的结果比较直观，但较费事。2）不进行调平，一个样品里将目的基因和BETA-ACTIN 直接比较，用软件就可以做到，然后将不同样品的这个比值进行比较就可以了。方法比较简单，但结果不够直观。1. 每个标本都要做自己的内参，不能用同一个内参！2. 每个标本在实际做前都要摸最佳循环数，包括内参，但内参