实验十DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离ppt课件

1、实验十实验十 片段从琼脂糖凝胶片段从琼脂糖凝胶中的分别中的分别DNA fragment recovery from the agrose gel一实验目的及背景一实验目的及背景w在生物技术实验中，反响获得的目的片段，酶切后所得特定的序列， 分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它分开， 这就需求有一套方法将目的从凝胶中分别出来，经过处置后得到纯化的目的， 以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等.从凝胶中分别回收的方法如今常用的技术有：电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法滤膜插片法等其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对的回收效果好。低熔点琼脂糖凝胶法w65oC琼脂糖凝胶熔点w

2、低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体滤膜插片法wHigh efficientwDNA high quality for microinjectionw5kb fragmentw100ng DNA fragmentw10mmol/L EDTApH8.0 5 minutesw0.5 mol/L NaOH 5 minutesw低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTApH8.0w高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTApH8.0电洗脱法根本原理w将电泳分别后含目的片段的琼脂糖切割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电

3、泳，这时目的会从凝胶中电泳出进入透析袋中， 由于分子量大，不能透过透析袋，从而保管于透析袋中。w取出透析袋中含的溶液， 进一步用酚、氯仿抽提纯化。二实验试剂及仪器二实验试剂及仪器wNaHCO3 2%wEDTA-Na2 0.01MwTBE电泳液w10.8g Tris碱w0.93g EDTAw5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000mlw琼脂糖 透析袋 酚 氯仿 乙醇 三、实验方法w一、透析袋的处置：w切取适当长度适析袋。w在NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸分钟。w弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。二、电洗脱w在长波紫外灯下nm 将含目的片段的凝胶条带切下装入透析袋中。w向透析袋内

4、参与ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。w将透析袋程度放入电泳槽长度方向与电泳平行， 参与适量缓冲液将透析袋浸没约mm。w接通电源，伏电洗，在紫外灯下察看待全部移出凝胶。w改动电场方向继续通电分钟。w从透析袋中吸出缓冲液于ml Eppendorf管中。w参与倍体积正丁醇，混匀抽提去。w在台式离心机上最高速分钟。w吸去上层，正丁醇溶液。w反复，二次。w自下层言的溶液中参与等体积酚氯仿个抽提次。w上清转入另一Eppendorf管中参与1/10倍体积3M NaAc 倍体积预冷无水乙醇，于过夜。w12000g，4下离心分钟，得沉淀。w弃上清，参与乙醇洗涤次后弃干乙醇。w参与l 溶解。w取l 溶液

5、参与2l Loading buffer于琼脂糖上， 伏电泳，小时。w在紫外透射仪上察看结果。w测定溶液OD260,OD280值。结果与分析结果与分析w计算回收效率，判别纯度。w记录电泳结果w问题与讨论：w电洗脱过程后，为什么要反向电泳分钟？w电洗脱后的如何去除？玻璃奶法快速纯化回收玻璃奶法快速纯化回收DNA片段片段本方法有多种用途，主要包括：从琼脂糖凝胶中分别纯化DNA片段；从DNA反响物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切衔接反响中的DNA片段；从探针制备反响物中去除未标志上的核苷酸以及小的DNA片段比如引物；DNA浓缩、去盐及去除杂质。本试剂盒的主要成分“基因纯试剂是无毒、无味

6、、无腐蚀作用的白色颗粒，能专注性结合0.2kb到50kb大小的DNA双链或单链，线性、环状或超螺旋，不结合RNA、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它能够抑制酶活性的有机或无机物。运用本法回收DNA片段有以下优点：w高纯度：回收的高纯度：回收的DNA片段根本上不含片段根本上不含RNA、蛋白质、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、衔接、探针制及其它有机分子，可直接用于酶切、衔接、探针制备、序列测定等；备、序列测定等；w简便：所需主要仪器是一架台式离心机；简便：所需主要仪器是一架台式离心机；w快速：整个回收过程只需半个小时；快速：整个回收过程只需半个小时；w高效：回收得率到达高效：回收得率

7、到达70%以上；以上；w多用途：可以同时作胶回收、多用途：可以同时作胶回收、PCR产物回收、产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等；片段及探针的纯化浓缩等；w平安：不接触苯酚、氯仿等有害物质。平安：不接触苯酚、氯仿等有害物质。二、试剂盒组成二、试剂盒组成w1碘化钠溶液： 50mlw2DNA洗涤液20倍浓缩液：10mlw3“基因纯试剂： 1mlw4超纯水： 1mlw运用前，将DNA洗涤浓缩液10ml倒入一玻璃瓶中，加140ml无水乙醇及50ml蒸馏水由运用者自配，混匀后置于-20冰箱中，其他溶液置于4冰箱。三、操作步骤三、操作步骤w从琼脂糖凝胶中分别纯化从琼脂糖凝胶中分别纯化DNA片段片段wa.

8、 常规常规DNA电泳。按常规方法用溴化乙锭电泳。按常规方法用溴化乙锭EB染色染色DNA，而后将欲分别的，而后将欲分别的DNA带从胶上切割下来，带从胶上切割下来，置于一置于一1.5ml离心管中。离心管中。wb. 称出凝胶带的分量，参与三倍量称出凝胶带的分量，参与三倍量V/W的碘化的碘化钠溶液。如钠溶液。如0.1g凝胶中参与凝胶中参与0.3ml碘化钠溶液。碘化钠溶液。wc. 置于置于55水浴水浴5-10分钟，直至凝胶完全溶化。分钟，直至凝胶完全溶化。wd. 参与参与20ul充沛混匀的充沛混匀的“基因纯试剂建议运用基因纯试剂建议运用前用漩涡振荡器振荡前用漩涡振荡器振荡3分钟，室温放置分钟，室温放置5

9、分钟期分钟期间不时将管子颠倒几次以混匀。间不时将管子颠倒几次以混匀。e. 离心10秒10,000rpm，倒去上清液。f. 加0.8ml刚从冰箱中取出的DNA洗涤液，充沛摇匀，离心10秒，去上清。g. 反复步骤f两次共洗涤三次。h. 用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。i. 参与20ul超纯水，混匀后置于55水浴5分钟。j. 离心3分钟，将上清液小心吸至另一个离心管，即为纯化的DNA。可直接用于酶切、亚克隆、PCR、标志、探针制备、序列测定、细胞转染等。本卷须知：本卷须知：溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应运用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。DNA洗涤液应坚持

10、在低温，否那么能够使DNA从“基因纯试剂上零落而导致回收率降低。步骤h是另一关键，管壁和管底残留的洗涤液假设不完全除去，能够导致“基因纯试剂上结合的DNA无法由蒸馏水洗脱。PCR反响物中纯化目的反响物中纯化目的DNA片段片段PCR反响终了后，加蒸馏水至100ul最后体积。参与300ul碘化钠溶液，混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分别纯化DNA片段中步骤d到j一样。从探针制备反响中除去未标志上的核从探针制备反响中除去未标志上的核苷酸及小的苷酸及小的DNA片段片段探针制备反响终了后，加蒸馏水至100ul最后体积。参与300ul碘化钠溶液，混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分别纯化DNA片段中步骤d到j一样。DNA浓缩，去盐及去除杂质浓缩，去盐及