提取RNA及用DEPC去除RNase的个人总结精华

1、快速的操作，低温环境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有 RNase污染。分子克隆第二版343页，上关于提取RN嘲用的玻璃容器的处理方法，是用前180度干烤8小时或更长时间；另一种方法是0.1%的depc水浸泡（37度2 小时）,然后灭菌水淋快速的操作，低温环境，少量取上清主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。分子克隆第二版343页，上关于提取RNA用的玻璃容器的处理方法 ，是用前180度干烤8小 时或更长时间；另一种方法是 0.1%的depc水浸泡（37度2小时）,然后灭菌水淋洗数次,100 度干烤15分钟,

2、然后高压灭菌除去 depc.我们实验室一直是用 170度考4小时，且不准离人， 不准过夜，可能是怕烤箱长时间高温，线路老化会发生危险吧提取RNA用的枪头，EP管。直接高压烘干即可。如果用 0.1 % DEPCM理，要在DEPCffi置 后振摇1小时后再浸泡枪头，EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会A. 对于提取 RNA来说，我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备，保存,以及之后的试剂的准备，匀浆器，镶子,tip头的去除RNase处理，尤其是去除RNase的DEPC 处理步骤

3、B. 您在处死大鼠前，先准备好干净的冻存管（用1.5ml的Ep管也可以，就是后面您在从液氮中 取出的时候容易爆，您的注意安全）,然后将去除的骨骼肌立即用干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小，装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPCM 理C. 在提取RNQ前，将试剂（TRIzol）和器械（tip头，镶子，匀浆器）都准备好D. 从液氮取出标本后，立即转移进入事先加入TRIzol的匀浆器内（最好置冰上操作）,立即匀浆，一直到标本完全碾磨碎，这个时候TRIzol液体成浑浊状，而且匀浆器的壁上没有太多的黏 附组织，然后将TRIzol转出，继续后续的步骤.1 Rnase是一

4、种蛋白酶，能够降解 RNA2我们的手上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。保护不被RNA病毒感染？或者什么的。3这个酶高效稳定。要么在DEP冰中处理n小时，要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会 失效。4所谓DEPC是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓DEPW, 一般指两种状态，a,配制 好未消毒；b,配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒。1无菌蒸储水中加入 0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC，室温搅拌4小时以上至完全溶解，高 压灭菌20分钟，冷却备用。这个是 DEP冰的b状态。2如果你要用DEP冰处理Tips等等东东，那么就要用高压前的水，即DEP冰的a状态

5、。把枪头管子等完全浸泡至少 8小时，我一般都是过夜的，或者平时就泡在里面备用。RN破取必须创造无 RNase的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理：研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在 180C烘干4h以上； 电泳槽、胶板、梳子、用 0.1 %0.2%DEPCK 处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用 0.5%的SDS （Sodium dodecyl sulfate ，抑制RNase的 活性）浸泡过夜，然后用 ddH2O冲洗干净，晾干备用；离心管，枪头等塑料器皿要用0.1%0.2%DEP冰处理之后（DEPC有致癌之嫌，须小心操作）。37C保温12h以上，然后高压灭菌，灭活DEPC （ Diethy

6、pyrocarbonate ）;溶液都需用经 DEPCM理过的水配置，RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。我们研究所里提 RN砒的枪头和EP管都是高压两遍的，没有用DEPCK处理。1、 有灭菌过的DEPC水，这一般是用来配 75%醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以 乙醇是新开封专用的。2、 没有经高压灭菌的 DEP冰，这主要是用于配你提 RNA所用的其他试剂（所说的试剂是 可以经高压灭菌的），总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去除DEPC以防止它以随 后实验的干扰。3、 DEPC处理水：无菌蒸储水中加入0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC，室温搅拌4小时以 上，121度高

7、压灭菌20分钟，冷却备用。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸储水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪哩环反应而 抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。试验所用试剂也可用 DEP或理，加入DEPCS 0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残 存的DEPC否则DEPO能和腺喋吟作用而破坏 mRN酷性。但DEPCt它与胺和疏基反应，因而 含Tris和DTT的试剂不能用 DEPCM理。Tris溶液可用DEPCM理的水配制然后高压灭菌。 配制的溶液如不能高

8、压灭菌 ，可用DEPCM理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂 .为啥在28s之后还是有影影约约的片断？和模糊的smear?这都与非变性电泳方式有关。RNA的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们平时所知道的RNA电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电泳实在是太方便了，同时，就一般检测而言，完全可以替代变性电泳，所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。电泳时间太长了容易产生降解。最好是在120V左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套，注意，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响RNA的质量。无论你是提什么RNAR要是用异丙醇沉淀的，都得用75%的酒精洗涤一次。1样品不要太多，抽提务必

9、充分，室温放置 5min;2 200ul氯仿 剧烈振荡 20s，室温放置 2- 15min；3 13000g 离心 15min;4取上层水相，一般400-450ul就足够了，千万不要贪多！*5加入500ul异丙醇 摇匀，室温放置10min；6 12000g 离心 10min ;7 75 %乙醇1000ul洗涤沉淀；8 7500g离心5min ; （ 12000转速太高了吧，沉淀不容易溶解的）9弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇，室温干燥3-5min；（时间太久沉淀不易溶解）10适量DEPCK溶解沉淀。电泳的上样量1ug,电泳buffer用DEPCM理的水配制，电泳时间不要太久，95V, 10- 15

10、min 足够了。建议跑RNA电泳。先用2%琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入RNAB抑制剂。注意观察带形，质量较好的RNA亮度。28S:18S应为2:1。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有带，若有，可能为基因组 DNA污染。OD值只有1.5 ,可能为基因组 DNA亏染。参考一下分子克隆 3。上面有OD值与污染DNA勺关系。建议，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的RNA羊品可用无RNA酶的DNA酶消化一下。注意该酶的buffer中有一种物质在OD260有吸光度，应严格按照其protocol操作，减少误 差。只要用DEPCM理过的水，打开一瓶新的无水乙醇（或者专用于RNA的，即只用处理过的枪头 取过乙醇的）配就可以了。DEPCW温高压时变成 CO2水，再加上乙醇也很容易气化，可能是因为有气体产生吧， 如果盖子太紧容易发生瓶子破掉的事情。（我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过）而且，湿热灭菌本身不足以去除RNAB,所以我觉得有时候，灭菌可能反而引入RNAB污染也不一定哦75%勺乙醇用于提取 RNA时