实时定量PCR技术原理

1、实时定量PCF技术原理基本概念定量PCR勺数学原理定量PCR勺化学原理等位基因鉴定原理定量PCF仪光学原理 基本概念什么是PCR?PCR能否只用一条引物？三条引物?PCR能否使用ddNTP典型的PCR四阶段指数增长期舊蛊长期基线期生物秀PCR!论方程N = NoX(1+e)N:产物分子数Nd：起始分子数 e：扩增效率 n:循环次数平台期循环次数起点定量与终点定量起点量是样本中原来的DNA量，更有意义； 终点量经过PCR放大，并非研究所期望的数据口 起点定量误差小，终点定量误差大标准曲线方法I3,125 Absolute amoiuit.通过CT值测定起始i6.250 (copies)DNA量i

2、ii12,500 25.00050.000EXi+100,000AC T scale 一- -IAbsoluteCTninouutSample A1650,000 copiesSatn卩便B1812,500 copiesShtuple C'196,250 copies定量PCR的数学原理什么是G值荧光信号有统计学意义显著增长（即穿过阈值线）时的循环次数 从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数线性图谱G例 NirrwrCt值 半对数图谱G值?浓度增加1倍，CT值减小1个单位?浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位 为什么G *起始DNA浓度？皿inR = RbX0(1+E 尸 R,当循环

3、次数门二值时：Rt = Rb-X0(1+H)ctR11? (R-t- Rb)=壊召 + CT1? (1+E)焯比CTlg (1-E) = - lg x-lg (Rt- Rb) - lg R. c贬鬆 l k>g(&r 二尺住7 - log(l-£r)log(l + EJ即CT = - k lg Xn + b (线性方程)G值与起始DNA浓度的关系?单拷贝检测在理论和实验上能做到吗?最理想的标准曲线斜率是多少? 什么是阈值基线信号的标准偏差X 10i CVU标准偏差基线f阈值fC T值基线调整规则如果G值18,不需调整，使用自动分析结果如果G值18,修改终点，再分析一次起

4、点：进口试剂取3,国产试剂取6 终点：最小的CT值-4,通常为15长度：大于或等于6个循环“illPCF方程只在指数期成立CT值和阈值必须位于指数增长阶段内Log DNA手工数据分析方法1. 实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱2. 如果G值 18,使用自动分析结果，出报告3. 如果有G值18,根据最小的G值-4修改基线终点，重新分析数据 软件自动的数据分析方法软件自动计算全部参数：基线、阈值、CT值、浓度Analysis Sttings 一 R巳lalive Quantifier* .Gene ExpressionCalihratorEndogenous Con

5、trolRQ lin/Iax195, oo |HK &一 ReanalyzeOKCancelApply?能否用鼠标拖阈值线以正确区分阴性与阳性?阈值与DNA浓度成反比，对吗？定量PCR的化学原理两种定量化学?染料染色-SYBR?Gree n I-溴乙锭(EthidiumBromide)?探针标记TM-TaqMan-TaqMa nMGB-Dual-oligoFRET pairs-分子信标(Molecular beac ons)Scorpio nsTM/AmplifluorTM1、TaqMan探 针y-TaqMan探针定量原理S'3*5'2.链取代3+ 丁旳酶的秤一3巧卜切

6、活性1< =报吿基团Reporter Q =淬灭基团Quencher2、共振能量转移荧光共振能量转移(FRET)当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离 足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量) 的荧光基团.这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于短波长荧光基团释放的荧 光被屏蔽。2、TaqManMG探针MGBS针能够分辨1个碱基的差别完全配对，有信号一个碱基不配对，没有信号TaqMa nMG探针原理生物秀提高探针Tm值AGGCCTTG(non-fluorescent quencher) NFQAGGCCTTGAGAGA

7、TAT MGB(minor groove binderGCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC.r) 报告菠光(NFQ)无荧光淬天墓团(G?) 沟结合肠MGBS针的优势NIFQ53 MGB提高信噪比-提高Tm值15 mer提高18° C-没有背景荧光-探针更短只要13-19个碱基-更咼的淬火效率-更多一重PC-TAMRA操针：枚鶉 mer: ACTTTTC TGT AAGTAGAT AT AAC TTTTC AA.iA.XG AC AGMGBfrtq 4£i7-mti'：CTGTAAGTAGATATjLiC两种探针比较Cycle Numb

8、er T m决定探针杂交特异性TAMRA(ATni = 6"C)MGBT*(ATm= 17°C70&C65*C5scCC?ATm = T m配对-T m不配对?要有效地区分等位基因，退火/延伸温度必须落在AT m区间内3、分子信标(Molecular beaco n)TaqMan探针的衍生形式4、杂交双探针TaqMan探针的衍生形式探针法小结既灵敏又特异：PCR与分子杂交的结合 双倍放大：PCR放大与荧光放大的结合?4种探针相比较，你更倾向于使用哪种?SYBR Green I 染料法SYBR Green I是一种DNA、沟结合染料SYBR Green I荧光染料在P

9、CRS程中染料与DNA吉合发光开始生物秀染料法小结成本低不需要探针适合初步筛查先用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品 熔解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体无模板特异性不能分辨主带与杂带，给出的是总信号 不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因灵敏度低适合于5000拷贝以上的基因定量熔解曲线(Dissociation curve)只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要 原始数据?能否用融解曲线区分点突变或 SNP?探针能做融解曲线吗？多里荧光疋量?原理同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基 因不同的探针标记不同的颜色。?特点一次提取DNA/RNA次反应得出多

10、个定量结果信号之间要保证互不干扰Match多色荧光技术荧光定量需要ROXJ正和IPC校正检材和对照可以在同一管中定量仪器须有多荧光检测能力推荐的4色组合 FAM冃的基因 VIC第二个口的基因或者TC TAMRA淬灭基团 ROX参比荧光荧光染料功能分类Reporter dye : 6-FAM、VIC、TET NEDQuen cher dye:TAMRA （TaqMa探 针）Dark Que ncher （MGB 探针）Refere nee dye: ROX-passive internal refere ncefor sig nal no rmalisati on-allows relative

11、 （not absolute） fluoresce nee to be measured -critical for precisi on7000 4色荧光> FAM/SYBR® Green I报人啖朮1染料> Vic JOEfit吿荧光2> TAMRA®淬灭荧光> ROE参比黄光7900 4色荧光FAIF11 S® Green I报告荧光1/染料 a VICTM/JOE报告荧光2> NED/TAMKA®报告/淬灭荧光参比焚光7300 4色荧光-FAif / SYBR工 Green I-VIC / JOE-TAMRA&quo

12、t; / XEDROX (歹比荧光passive reference)7500 5色荧光?5片激发滤色片、5片发射滤色片一 VIC. JOE一 NED, TANKA. CY3 DyeROX (passive reference)T Texas Red1-CY5 Dye?增加荧光无须硬件变动：多重荧光解析算法软件 ?你为什么会想到做多重定量？?多重定量能达到目的吗？等位基因鉴定原理 两种探针加入同一管MlKiTiLahMiiMaltolMumatchUHBM位基因鉴定实验分两步PER试剂+弓I物探针+ 2昭样晶 4主物秀等位基因鉴定实验数据定量PCR仪光学原理 光学结构简图实时结果光源灯AB定量PCF仪大家族第一代7700和5700第二代70007900第三代7300和75007700 ： 4 色7000 :中小规模7300 :三重定量7500 : 5色检测5700 :单色7900 :澈光源定量PCR仪功能一览?绝对定量(Absolute Qua ntificati on)-自动计算基线、阈值、CT