葡聚糖凝胶常见问题

1、14 1在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同？那进行梯度洗脱会不会有影响？答：当然有影响,Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的（任何填料 都是这样，只是Sephadex LH20很明显），一般在丙酮，乙酸乙酯 中收缩很厉害， 所以一般不用丙酮，乙酸乙酯 作溶剂，如果前后使用的两种洗脱溶剂对 Sephadex LH20的吸涨程度相差很大，还会产生大量气泡.以下列举了 1g十态 的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：water 2.1ml MeOH 1.9mlEtOH 1.8ml CHCI3 1.6mln-BuOH 1.6ml丙酮 0.8ml乙酸乙酯0.4ml甲

2、苯0.2ml2样品的溶解是不是要与洗脱的起始浓度相同 ？如何确定样品在最佳配比的容液 中溶呢？答：样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同，但有时（其实是多数情况下），都办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是（1）样品一定要溶解（Sephadex LH20很贵，要保护填料，我看植化的同志对好 填料看得都很重，同时，避免样品不溶解造成的脱尾）（2）溶解样品的体积尽可能小（色谱分离理论的基本要求，减小原始谱带宽度）（3）样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同（若样品的溶解溶剂比洗脱的起使浓 度洗脱能力强，则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力； 同时若样品的溶解溶剂 与洗脱的起使溶剂差别很大，样品

3、可能以为溶解性的问题而析出。）以上三点是上样的基本要求，有时很难求全，只有根据具体的实际来决定了。 一般做法是满足1, 2点，尽量满足第三点，“如果样品极性大，则选用反相溶 剂洗脱（甲醇一一水）,样品用最少体积的甲醇一一水（尽可能甲醇少一些）溶 解”。3分到什么程度再用Sephadex LH20比较好?"答：如果实验室Sephadex LH20艮珍贵，分到较纯再用，如果实验室SephadexLH20很普及，只要满足使用的注意事项，较粗的样品可直接使用Sephadex LH20分离。设想如果硅胶比 Sephadex LH20还贵，你一定先用 Sephadex LH20粗分， 再用硅胶吧

4、。有4上样体积与柱体积最小的比是多少？我用 100克的填料，如果样品不好溶，那 一次最多能上多少毫升的样呢？答：（1）在分离过程中遇到要分离的样品量很大，而柱层填料相对较少的情况是 很多的.一般解决的途径有两条：a）将样品一次全上柱，这样分离效果一定不会好，但我们的侧略是将样品交叠的 部分再上一遍或几遍，这叫反复xxxx柱层，好处是工作量小。b）将样品分几次分别分离，这样每次分离的效果一定比将样品一次全上柱的分离效果好，但这样有一个很大的弊病，就是每次柱层的条件不可能保持完全一至， 这样几次柱层分离的僻分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层僻分合并的过程中，合的太粗，就如同将样品一次

5、全上柱的合并结果，只是工作量增大了。所以推荐的做法是将样品一次全上柱，再通过反复柱层的方法来逐步提高分离效果。100g填料已不少了， astra兄的样品如果实在太多，就只好分开上柱了 . 一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定，在柱床体积的1/10吧。5使用Sephadex LH20上柱前不纯，上柱后目标产物仍然不纯，感觉东西越分 越少；在实验过程中，也总担心会把东西弄没了，总不敢轻易采取行动，所以分 离进展非常慢，能指点迷津么？答：样品经过分离一般而言会产生两种结果：（1）目标组分的相对纯度提高，因为经过分离后各组份分别在不同的僻分富集， 当然在富集目标组分的僻分中目标组

6、分的含量要比总样中的含量要高 ，所以我们 说目标组分得以纯化.（2）目标组分的绝对量减少，因为无论是什么分离手段，物质的分离总会有交义,意即不但目标组分分布于主要富集目标组分的僻分中，相邻僻分中也定会有它的 踪影，只是可能不是相邻僻分的主成分，从分离的角度，那些相邻僻分并非是我们 想要的，我们只将目标组分的相对含量高的僻分用于下一步分离，这种结果必然是与原样相比用于下一步分离的僻分中目标组分的绝对量要少一些.6试着用少量的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理，有没有好的办法 呢？答：（1）这里提到“用少量的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理”是 指甲醇水难蒸十吗？其实这根本不应成

7、为问题。请想一想，做植化专业都会遇到甲 醇水的时候，ODS柱层用甲醇水洗脱，Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱，D101 用乙醇水洗脱，HP20用甲醇水洗脱，高效液相最常用的是反相，流动相还是甲 醇水，可见甲醇水是植化专业最亲密的朋友，所以蒸不十也想办法蒸十 !（2）像水这种高沸点的溶剂是很难蒸十的，办法是有的，先看看旋转薄膜的几个 要素：真空度，冷凝液，蒸发温度.a）真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性.一般的国产水泵就能满足日常的 需要（包括蒸水），但一定注意的是水泵的循环水一定要开，如果不开循环水，水泵 中的水很快就会变得很热，将极大地减少水泵的效率，且会将抽出的溶剂挥散出 来,

8、很不好！比国产水泵更好的是进口水泵，比进口水泵更好的是隔膜泵，系统的 密闭性就更重要了 ，特别是蒸像水，丁醇这样的溶剂，对系统的密闭性的要求很高，对于系统密闭性不好时，可采用逐步拆分法来查漏，最容易出问题的地方在垫 圈，国产的旋转薄膜配的垫圈很烂，全不耐氯仿等有机溶剂，当用国产的旋转薄膜 蒸过氯仿等有机溶剂，垫圈就废了.所以要多预备几个垫圈.b）冷凝液一般使用水，如果配一台冷阱，使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液，效果棒极了c）提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率，但可能发生物质的变化，国产旋转薄 膜，水泵，用水冷，当然就只好提高蒸发温度了 向要蒸的水溶液中加甲醇，使甲醇占到30%蒸出速度将大大

9、提高！7 一旦Sephadex LH20柱子被弄脏了，有什么办法来处理么？答Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤，将柱头堵 住，或由于样品的死吸附（一般很少发生），使柱子的柱头部分污染，一般的处理是 将被污染的柱头部分的填料弃去，具体做法很简单，只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起，倒掉即可，（2）如果柱子整个被污染，如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下 依次用水，NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被 污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上 （如果完全死吸附在柱上，污染物 一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。NaOH-NaC水溶液配法：8g NaOH ,30g NaCl , 1000ml 水8不知道用反相柱分离合用LH-20那个效果比较好？同时如果用同一根 LH-20 的话，洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗？答：（1） Sephadex LH-20主要还是分子筛的作用机理，在非极性溶剂中有一定 的反相柱效果。如要分离的物质在反相板上分离效果好，那么大可在反相柱中进 行分离；如果要分离的物质分子量相差较大，当然是SephadexLH-20效果好。实际使用中往往