实验五、植物组织中过氧化氢酶的活力测定ppt课件

1、 实验五、植物组织中过氧化氢酶活力测定高锰酸钾滴定法高锰酸钾滴定法一、实验目的一、实验目的l1.掌握酶活力测定的方法l2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理二、实验原理二、实验原理l过氧化氢酶CAT属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传送电子的作用，过氧化氢那么既是氧化剂又是复原剂。lR(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3+OH)lR(Fe3+OH)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2l据此，可根据据此，可根据H2O2的耗费量或的耗费量或O2的生成量测的生成量测定该酶活力大小。在反响系统中参与一定量定该酶活力大小。在反响系统中参与一定量反响过量

2、的反响过量的H2O2溶液，经酶促反响后，溶液，经酶促反响后，用规范高锰酸钾溶液在酸性条件下滴定多用规范高锰酸钾溶液在酸性条件下滴定多余的余的H2O2，即可求出耗费的，即可求出耗费的H2O2的量。的量。l5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4 =5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4三、资料、试剂与器具三、资料、试剂与器具 1.资料：小麦叶片资料：小麦叶片2.试剂试剂110% H2SO4；20.2mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液pH7.8；30.1mol/L高锰酸钾规范液：称取高锰酸钾规范液：称取KMnO4AR3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，

3、用，用0.1mol/L草酸溶液草酸溶液标定；标定；40.1mol/L H2O2：市售：市售30% H2O2大约等于大约等于17.6mol/L，取取30% H2O2溶液溶液5.68ml，稀释至，稀释至1000ml，用规范，用规范0.1mol/ KMnO4溶液在酸性条件下进展标定；溶液在酸性条件下进展标定；50.1mol/L草酸：称取优级纯草酸：称取优级纯H2C2O4 2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至用蒸馏水溶解后，定容至1L。3.器具器具1恒温水浴；恒温水浴；2研钵；三角瓶研钵；三角瓶50ml4；酸式滴定管；酸式滴定管10ml；容量瓶；容量瓶25ml1等等四、实验步骤四、实验步骤

4、1.酶液提取酶液提取取小麦叶片取小麦叶片2.5g参与参与pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，缓冲液定容，4000rpm离心离心15min，上清液即为，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。过氧化氢酶的粗提液。2.反响反响取取50ml三角瓶三角瓶4个两个测定两个对照，测定瓶个两个测定两个对照，测定瓶中参与酶液中参与酶液2.5ml，对照瓶中参与煮死酶液，对照瓶中参与煮死酶液2.5ml，再参与再参与2.5ml 0.1

5、mol/L H2O2，同时计时，于，同时计时，于30恒温水浴中保温恒温水浴中保温10min，立刻参与，立刻参与10% H2SO4 2.5ml。3.滴定滴定用用0.1mol/L KMn4规范溶液滴定规范溶液滴定H2O2，至出现，至出现粉红色在粉红色在30min内不消逝为终点。内不消逝为终点。五、计算五、计算l酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示l酶活(mgH2O2/gmin)=l式中： l A对照KMnO4滴定毫升数；l B酶反响后KMnO4滴定毫升数；l VT酶液总量ml；l V1反响所用酶液量ml；l F W样品鲜重g；l 1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2().ABVFWVtT171六、研讨题六、研讨题l1.影响过氧化氢酶活力测定的要素有哪些影响过氧化氢酶活力测定的要素有哪些?l2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关过氧化氢酶与哪些生化过程有关?l3.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是法，原理是H2O2在在240nm波长下有剧烈吸收，过氧化氢波长下有剧烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反响溶液吸光度酶能分解过氧化氢，使反响溶液吸光度(A240)随反响时间随反响时间而降低。根据丈量吸光率的变化速度即可测出过