试验二细菌培养与代谢产物检查

1、实验二细菌培养与代谢产物检查【目的】 学习并初步掌握基础培养基制备方法。 了解细菌生长繁殖所需要营养以及常用培养基的种类和用途。 了解细菌所具有的不同生化反应及代谢产物，以利细菌的鉴定和鉴别 规范地进行无菌操作。一、基础培养基的制备（一）培养基的制作程序培养基制作的一般程序：准确称量培养基的各种成分T混合溶解T测定及矫 正pH分装、包装T灭菌T检定T保存备用。（二）常用培养基的种类按培 养基 的作用分为： 基础培养基：含有细菌需要的最基本营养成分（蛋白月东1%,牛肉膏0.3%, 氯化钠0.5%，用蒸僻水溶解）。按其性状不同可分为：（1）肉汤培养基。（2）普 通琼脂培养基。分斜面和平板培养基，内

2、含 23%的琼脂，呈固体状。（3）半固 体培养基，含0.20.5%的琼脂。 营养培养基：供营养要求较高的细菌用，如血琼脂培养基（在普通琼脂培养基中加入5%10%的脱纤维动物血）。 选择培养基：如SS琼脂培养基，可选择性抑制非病原菌生长，有利于分 离病原菌。 鉴别培养基：如含铁双糖培养基，用以鉴定细菌。 厌氧培养基：如庖肉培养基，用以培养厌氧菌。（三）基础培养基的制备过程1、肉汤（肉浸液）培养基【材料】牛肉、蛋白月东、氯化钠、水（蒸僻水或自来水）、NaO船液（1N和N/10）、 0.02%酚红指示剂、吸管等。【方法】 取新鲜瘦牛肉，除去脂肪及筋膜，切成小块后用绞肉机绞碎，每 500g碎 肉加水1

3、000ml，混合置4C冰箱过夜（使营养物质即溶解性蛋白质充分渗出）。 次日取出煮沸半小时左右，使肉渣蛋白质全部凝固；加热过程中不时地用 玻璃棒搅拌，以免沉淀烧焦。也可不放置冰箱过夜，直接煮沸 1小时。 用数层纱布过滤，弃去肉渣（肉渣中的液体应尽量挤净），于滤液中加入 1%蛋白月东及0.5 %氯化钠，加热溶解，并补足失水至 1000ml。 冷却到50C在右，以N/10 NaO曲至pH值7.67.8。 待pH矫正后，再加热10min,使肉汤中部分蛋白质等因加碱及再度加热 而凝固沉淀。过滤并补足失水，重复矫正 pH值一次， 将上述制备的肉汤分装于烧瓶或试管中，瓶口或管口加塞并包扎，经 103.34k

4、Pa（15磅）20min高压灭菌后，置冰箱中或十燥阴凉处备用。【用途】用作基础培养基，其营养比肉膏汤好，一般营养要求不高的细菌均可生长。2、肉膏汤培养基牛肉膏系将牛肉汤加热浓缩而成，每1000毫升能浓缩成肉膏约70克。牛肉 膏汤可代替牛肉汤来培养细菌，由于经长时间加热，部分营养成分（如糖分）已损 失，故其营养价值略低于牛肉汤。但肉膏汤制作手续简单，制品透明活晰，酸碱 度变化较小，故仍常用。【材料】牛肉膏、蛋白月东、氯化钠、水、氢氧化钠溶液、0.02%酚红指示剂、吸管等。【方法】 将牛肉膏35g、蛋白月东10g、氯化钠5g加于1000ml水中，用玻棒搅拌 使其溶解。必要时加热使其溶解。 矫正至p

5、H7.47.6，煮沸35min,过滤。 分装于适当容器内，高压灭菌15磅20min,置冰箱中或十燥阴凉处备用。【用途】供一般细菌培养用。3、肉汤琼脂固体培养基琼脂是海藻糖中提取出的一种多糖类物质， 对病原性细菌无营养作用。加入 培养基的目的是使之固态化，因其熔化点为100C ,凝固点约40C，利用此特性， 加至肉汤或肉膏汤内后，趁热可制得斜面，平板等不同类型的固体培养基，以供 分离培养、繁殖细菌等用。【材料】pH7.6牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空试管、灭菌培养也 （9cm直径）。【方法】 于pH 7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，加入23%琼脂，加热溶化。 以脱脂棉过滤去除杂质（或不过滤），分装烧瓶或

6、试管（琼脂斜面每管 5m1）。 经15磅20min高压灭菌后，趁热将装有5ml肉汤琼脂之试管斜置，待冷凝后即成琼脂斜面培养基。高层琼脂的分装量约为试管长度的1/4或1/3;若接种厌氧菌则应为试管长度的2/3。烧瓶中肉汤琼脂冷至5060 C时，以无菌 操作法将其倾入灭菌空培养皿中（每也1520ml）,迅速盖上也盖，并将培养也 于桌面轻轻回转摇动，使皿内培养基平铺皿底，待冷凝后即成琼脂平板培养基。【用途】 琼脂斜面培养基用于纯种细菌接种以保存一般菌种。 琼脂平板培养基用于细菌的分离培养。4、肉汤琼脂半固体培养基【材料】pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空小试管（10 x 100mm）【方法】 丁

7、 pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，加入0.30.5%琼脂，加热溶化后， 过滤并补足失水。 分装丁小试管中，每管3ml，经15磅20min高压灭菌后直立冷凝即成。【用途】常用丁细菌的动力检查和菌种保存。5、干燥培养基干燥培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾、真空、低温、蒸发等干燥方法，将培养基内水分去掉后形成各种固形成分，经过适当处理使成干燥粉末状。 用时只要按一定比例加入一定量的蒸僻水， 经过溶解、分装、高压灭菌即可应用。 其优点是节省时间、使用方便。二、细菌的接种法（一）分离培养法细菌种类多且分布广，因此临床标本如粪便、痰、脓等以及水、牛乳中常含 有多种细菌。应用分离培养法可获得检材中某一种

8、细菌，亦可使被污染的菌种重 新分纯。【材料】葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液、普通琼脂平板。【方法】当标本中含有两种以上细菌时，可用平板划线接种法。划线方法很多，平板 分离划线接种为常用的分离培养法，最后均使混杂的细菌在琼脂平板表面分散， 形成菌苔；或者使单个细菌固定在一点上生长繁殖， 形成单个菌落而得到纯种细 菌。操作方法：右手持接种环，火焰灭菌后，挑取待分离标本一环；左手持 琼脂平板，以左手拇指和食指将平板盖开启，右手将沾有检材之接种环伸入平板， 与平板培养基表面成450角，如图所示，在培养基表面分区划线（每区划线后， 接种环都须经火焰灭菌），盖好平板。最后接种环火焰灭菌；在平板底上标好 组

9、别、姓名、日期等（标签纸写好后贴上）。将平板底朝上、盖朝下放入 37C 温箱中培养，24小时后观察结果。平板划线接种法【观察结果】观察琼脂平板培养基表面菌苔以及单个菌落生长情况，即观察琼脂平板培养 基表面单个菌落的大小、形状、突起、边缘、菌落表面、湿润度、透明度及颜色 等性状。挑取单个菌落可获得纯培养。（二）纯种细菌培养法各种检材经分离培养得纯种细菌后，若需保留菌种或进一步测试其生化反应 等生物学特性时，必须进行纯种细菌培养。根据常用培养基的物理性状，纯种细 菌培养接种法有以下几种。1、琼脂斜面培养基接种法凡具有斜面外形的的固体培养基均采用此种方法接种细菌。【材料】琼脂斜面培 养基、 大肠埃希

10、菌琼脂斜面 1824小时培养物。【方法】 右手持接种环，火焰灭菌后，在琼脂板上挑取单个典型可疑菌落少许； 左手持斜面培养基试管，右手掌和小指拨出棉塞，将挑有细菌的接种环伸 入试管内。 在培养基表面划线后，塞好棉塞，接种环火焰灭菌；放入37C孵育24小时后观察。 预先在试管1/3处标好组别、姓名、日期等。琼脂斜面接种法【观察结果】观察斜面表面菌苔生长情况。2、半固体培养基接种法半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基及明胶培养基等均用本法接种细菌。【材料】半固体琼脂培养基、痢疾志贺菌及大肠埃希菌斜面培养物。【方法】右手持接种针，火焰灭菌后，挑取菌落或菌苔少许，垂直刺入半固体培养基 的中央，深入管内培养基的

11、3/4处，再循原穿刺线退出。放入37C孵育24小时 后观察。【观察结果】观察细菌能否运动。有鞭毛菌能运动，细菌沿穿刺线扩散生长，使培养基 呈毛玻璃样混浊；而无鞭毛菌则不能运动，细菌沿穿刺线生长，其周围培养基仍 为原来的透明度。液体培养基、半固体培养基接种法3、液体培养基接种法【材料】肉汤、葡萄糖蛋白豚水及各种单糖发酵管等液体培养基都用本法接种细菌。材料为普通肉汤培养基、大肠埃希菌琼脂斜面 1824小时培养物。【方法】 右手持接种环，火焰灭菌后，用接种环挑取菌落少许，如图所示，在接近培养基液面的管壁上轻磨后，竖直试管，使接种的细菌混入培养液（图9-3A） 各种培养基接种细菌后，即放入 37C温箱

12、中培养24小时，观察结果。【观察结果】细菌生长情况：均匀混浊、菌膜、沉淀。（三）细菌在培养基中生长现象1、细菌在液体培养基中生长现象，观察结果并填入下图。细菌在液体培养基中生长现象2、 细菌在平板培养基上生长现象，观察结果并填入图9-1。细菌在 区生长最多，形成 ，在 区生长最少，可见单个 。3、细菌在半固体培养基中生长现象，观察结果并填入图。本法为检查细菌动力的试验，凡细菌沿穿刺线向周围扩散生长者，说明该菌 有鞭毛，为动力试验阳性，只沿穿刺线生长为阴性。细菌在半固体培养基中生长现象三、细菌分解代谢产物检查【原理】细菌的新陈代谢受一系列酶的控制， 各种细菌乂具有各自独特的酶系统，因 而在代谢过

13、程中所产生的分解和合成代谢产物也不相同，这些代谢产物乂各具有不同的生化特点。根据此特点，利用生物化学方法来鉴别不同的细菌称为细菌的 生化反应。这些试验在鉴别和鉴定细菌方面起着重要作用。（一）糖发酵试验【原理】各种细菌因含有发酵不同糖类的酶，因而分解各种糖 （醇）类的能力各不相 同。有些能分解糖（醇）产酸，使指示剂变色，有些能产酸产气，有些则不能分解。 据此可鉴别细菌的种类。糖发酵管是将葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇或蔗糖等加入蛋白豚水培养基内，使其最终浓度为0.75 %1 %,并加入一定量的漠甲酚紫指示剂和 1支倒置 的小管，管内液体为紫色。接种细菌经 37C孵育，细菌分解糖后，若产酸，则 使培

14、养基变色。其颜色由所加指示剂而定，如指示剂为漠甲酚紫，则由紫色（碱性）变成黄色（酸性）；如为酚红，则由红色变成黄色。一般以 斗”表示产酸；若 产酸、产气，不仅培养基变色，而且倒置小管内出现气泡，以 表示；若不分 解该种糖，则无以上两种现象，以 巴表示。【材料】葡萄糖发酵管（乳糖）、产碱杆菌、伤寒沙门菌及大肠埃希菌斜面培养物。【方法】分别将产碱杆菌，伤寒沙门菌及大肠埃希菌接种于葡萄糖发酵管中，置37 C孵箱中培养1824小时。产碱杆菌不分解葡萄糖（-）；伤寒杆菌分解该糖产酸不产气（+ ）;大肠埃希 菌则产酸产气（® ）。（二）呵噪（靛基质）试验（Indol试验）【原理】某些细菌具有色氨

15、酸酶，能分解蛋白月东水中的色氨酸生成呵噪（靛基质），呵 噪本身无色，不能直接察见，加入呵噪试剂（对二甲基氨基苯甲醛）则形成红色的 玫瑰口引噪，易被肉眼察见。【材料】蛋白月东水培养基、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌1824小时斜面培养物、 口引噪试剂。【方法】分别接种大肠埃希菌及乙型副伤寒沙门菌于蛋白月东水培养基中。37 C孵育2448小时。【观察结果】沿管壁各加入口引噪试剂0. 5ml，约隔1min左右，在二层液面交界处如出现 一圈玫瑰红色，即为呵噪试验阳性，若不出现红色，则为呵噪试验阴性。（三）硫化氢试验【原理】某些细菌能分解培养基中的胱氨酸等含硫氨基酸， 产生硫化氢，硫化氢遇铅 盐（或铁盐）则形成黑褐色的硫化铅（或硫化铁）沉淀物。黑褐色沉淀物愈多，表示 形成的硫化氢量亦愈多。硫化氢试验用的培养基中含有硫代硫酸钠， 能保持还原 环境，使形成