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文档简介
1、实验2水中大肠菌群数的测定一、目的要求1. 了解大肠菌群数量在引用水中的重要性2. 学习掌握多管发酵法和滤膜法测定大肠菌群数二、原理若水源被粪便污染,则有可能也被肠道病原菌污染,然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异,因此数量较少,要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时,这样就要找到一个合适的指示菌,此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌,并且和水源病原菌相比是较易检出的。若指示菌在水中不存在或数量很少,则大多数情况也保证没有病原菌。最广泛应用的指示菌是大肠菌群,它的定义是:一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌,并在乳糖培养基中,经370C、2448h培养能产酸产气,根据水中
2、大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染,并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。我国规定每升自来水中大肠菌群不得检出;若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水,大肠菌群数平均每升不得超过 1000个;经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水,其大肠 菌群数平均每升不得超过 10000个。检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法使用历史较久,又称水的标准分析方法,为我国大多数卫生单位与水厂所采用; 滤膜法是一种快速的替代方法, 而且 结果重复性好,又能测定大体积的水样,目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。三、实验仪器和材料1 .锥形瓶(500 ml)、试管(18 mm X
3、 180 mm )、大试管(容积 150 ml )、移液管1 ml 及10ml、培养皿(直径 90 mm)、接种环、试管架 1个。2. 革兰氏染色液一套:草酸铉结晶紫、革氏碘液、 95%乙醇、蕃红染液3. 显微镜4. 自来水(或受粪便污染的河、湖水)400ml5. 蛋白月东、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、1.6%漠甲酚 紫乙醇溶液、5%碱性品红乙醇溶液、2%伊红水溶液、0.5%美蓝水溶液。6. 10% NaOH、10% HCl、精密 pH 试纸 6.48.4。四、实验前准备工作(一)配培养基1. 乳糖蛋白腺培养基(供多管发酵法的复发酵用)配方:蛋白月东10g、牛肉膏3g
4、、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%漠甲酚紫乙醇溶液 1 ml、蒸 储水 1 000ml、pH = 7.2 7.4。制备:按配方分别称取蛋白月东、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1 000 ml蒸储水,调整pH为7.27.4。加入1.6%漠甲酚紫乙醇溶液 1 ml,充分混匀后分装于试管内,每管 10 ml,另取一小倒管装满培养基倒放入试管内。塞好棉塞、包扎。置于高压灭菌锅内以 0.7kg/cm2 (115C)灭菌20min ,取出置于阴冷处备用。2. 三倍浓缩乳糖蛋白腺培养液(供多管法初发酵用)按上述乳糖蛋白腺培养液浓缩三倍配制,分装于试管中,每管 5ml。再分装大试管,每 管装50ml,然后在每管
5、内倒放装满培养基的小导管、塞棉塞、包扎,置高压灭菌锅内以 0.7kg/cm2 (115C)灭菌20min ,取出置于阴冷处备用。3. 品红亚硫酸钠培养基(即远滕氏培养基),供多管发酵法的平板划线用配方:蛋白腺10g、乳糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂2030g、蒸储水1000ml、无水 亚硫酸钠5g左右、5%碱性品红乙醇溶液。制备:先将琼脂加入900ml蒸储水中加热溶解,然后加入磷酸氢二钾及蛋白腺,混匀使之溶解,加蒸储水补足至l 000 ml,调整pH为7.27.4,趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加入乳糖,混匀后定量分装于锥形瓶内,置高压灭菌锅内以0.7 kg/cm2灭菌20min ,取出置于阴
6、冷处备用。现市场上有售配制好的乳糖发酵培养基,使用方便。4. 伊红美蓝培养基配方:蛋白腺10g、乳糖10 g、磷酸氢二钾2g、琼脂2030 g、蒸溜水1000ml、2%伊红水溶液10 ml、0.5%美蓝水溶液13 ml制备:按品红亚硫酸钠的制备过程制备。现市场上有售配制好的伊红美蓝培养基,使用方便。五、实验方法与步骤(一)大肠菌群的测定1 .多管发酵MPN法(按三个步骤进行)多管发酵法适用于饮用水、水源水,特别是浑浊度高的水中的大肠菌群测定。(1)生活饮用水的测定步骤 初步发酵试验 在2支各装有50 ml三倍浓缩乳糖蛋白月东培养液的大发酵管中, 以无 菌操作各加入100ml水样。在10支各装有
7、5 ml三倍浓缩乳糖蛋白月东培养液的发酵管中, 以 无菌操作各加入10ml水样.混匀后冒于 37oC恒温箱中培养24h,观察其产酸产气的情况。情况分析:a. 若培养基红色不变为黄色,小导管没有气体,即不产酸不产气,为阴性反应,表明 无大肠菌群存在。b. 若培养基由红色变为黄色,小导管有气体产生,即产酸又产气,为阳性反应,说明 有大肠菌群存在。c. 培养基由红色变为黄色说明产酸,但不产气,仍为阳性反应,表明有大肠菌群存在。 结果为阳性者,说明水可能被粪便污染,需进一步检验。d. 若小倒管有气体,培养基红色不变,也不浑浊,是操作技术上有问题,应重作检验。 确定性试验用平板划线分离,将经培养 24
8、h后产酸(培养基呈黄色)、产气或只产酸不产气的发酵管取出,以无菌操作,用接种环挑取一环发酵液于品红亚硫酸钠培养基(或伊红美蓝培养基)平板上划线分离,共三个平板。置于37C恒温箱内培养1824 h,观察菌落特征。如果平板上长有如下特征的菌落并经涂片和进行革兰氏染色,结果为革兰氏阴性的无芽孑包杆菌,则表明有大肠菌群存在。在品红亚硫酸钠培养基平板上的菌落特征:a. 紫红色,具有金属光泽的菌落;b. 深红色,不带或略带金属光泽的菌落;c. 淡红色,中心色较深的菌落。在伊红、美蓝培养基平板上的菌落特征:a. 深紫黑色,具有金属光泽的菌落;b. 紫黑色,不带或略带金属光泽的菌落;c. 淡紫红色,中心色较深
9、的菌落。 复发酵试验以无菌操作,用接种环在具有上述菌落特征、革兰氏染色阴性的无芽弛杆菌的菌落上挑取一环于装有10ml普通浓度乳糖蛋白腺培养基的发酵管内,每管可接种同一平板上(即同一初发酵管)的 13个典型菌落的细菌。盖上棉塞置于 37oC恒温箱内培 养24h,有产酸、产气者证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性菌(瓶)数查表。报告每升水样中大肠菌群数。(2)水源水中大肠菌群的测定步骤(一) 稀释水样根据水源水的清洁程度确定水样的稀释倍数,除严重污染外,一般稀释倍数为10-1及10-2,稀释方法如实验七中所述的10倍稀释法(均需无菌操作)。初步发酵试验 以无菌操作,用无菌移液管吸取 1
10、ml 10-2、10-1的稀释水样及l ml原 水样,分别注入装有 10 ml普通浓度乳糖蛋白腺培养基的发酵管中,另取10ml原水样注入装有5 ml三倍浓缩乳糖蛋白月东培养基的发酵管中 (注:如果为较清洁的水样,可再取100ml 水样注入装有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白月东培养基发酵瓶中) 。置37cC恒温箱中培养24h后 观察结果。以后的测定步骤与生活饮用水的测定方法相同。根据证实有大肠菌群存在的阳性管数或瓶数查表,报告每升水样中的大肠菌群数。(3)水源水中大肠菌群的测定步骤(二) 稀释水样 将水样作10倍稀释。 于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白月东培养液的 5个试管中,各加10ml水样。于装有
11、10 ml乳糖蛋白月东培养液的 5个试管中,各加l ml水样。于装有10ml孚L糖蛋白月东培养液的 5 个试管中,各加1 ml 10-1的稀释水样。三个稀释度,共计15管。将各管充分混匀,置于370C 怛温箱中培养24h。 平板分离和复发酵试验的检验步骤同“生活饮用水检验方法”。 根据证实大肠菌群存在的阳性管数查表,即可求得每 100ml水样中存在的大肠菌群 数。乘以10即为1L水中的大肠菌群数。2.滤膜法适用范围:适用于测定饮用水和低浊度的水源水(1)原理:滤膜是一种微孔薄膜,孔径 0.450.65微米,能滤过大量水样并将水中含有的细菌截留在滤膜上,然后将滤膜贴在选择性培养基上,经培养后,直
12、接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落,算出每L水样中含有的大肠菌群数。(2)仪器与材料:除与多管发酵法的相同外,另还有:过滤器、抽滤设备、无菌镶子、 滤膜(直径3.5 cm和4.7 cm)。(3)培养基: 品红亚硫酸钠培 养基 (乙)配方:蛋白月东10g、酵母浸膏5g、牛肉膏5g、孚L糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂15 20g、无水亚硫酸钠 5g左右、5%碱性品红乙醇溶液 20ml、蒸储水1 000ml, pH = 7.27.4。乳糖蛋白腺培养液(与多管发酵法相同)。乳糖蛋白腺半固体培养基:配方:蛋白腺10g、牛肉膏5g、酵母浸膏5g、乳糖10g、琼脂5g、蒸储水l 000ml, pH =7
13、.2 7.4。(4)操作步骤:首先要作好准备工作,而后才是过滤水样。准备工作主要是滤膜和滤 器的灭菌。滤膜灭茵时,将滤膜放入烧杯中,加入蒸储水,置于沸水浴中煮沸灭菌三次,每次15min,前两次煮沸后需更换蒸储水洗涤23次,以除去残留溶剂。滤器灭菌使用高压灭菌锅在121oC下,灭菌20min。过滤水样时,用无菌镶子夹住滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴在滤器上,稳妥地固定好滤器,将333ml水样(如果水样中含菌量多,可减少过滤水样)注入滤器中,加盖,打 开滤器阀门,在-500Pa下抽滤。水样滤毕,再抽气5s,关上滤器阀门,取下滤器,用镶子夹住滤膜边缘移放在品红亚硫酸钠培养基平板上,滤膜截留细菌面向上, 滤膜应与培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将平皿倒置,放入37oC恒温箱内培养2224h后观察结果。挑取具有大肠菌群菌落特征的菌落(菌落特征见上述多管发酵法)进行涂片、革兰氏染色、镜检。将具有大肠菌群菌落特征、革兰氏染色阴性的无芽弛杆菌接种到乳糖蛋白腺培养液或乳 糖蛋白月东半固体培养基。经37C培养,前者于 24h产酸产气者;或后者经 68h培养后产气者,则判定为大肠菌群阳性。计算每L水样中大肠菌群数,即将平板上长出的大肠菌落总数乘以3。六实验报告1记录结果,根据你的结果判断所取水样
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