转基因作物及产品检测技术研究进展

1、转基因作物及产品检测技术研究进展转基因检测技术是转基因作物研究和安全管理的基础和技术保障。一方面， 作为研发者，在研究过程中需要一套高效准确的检测技术去鉴定转基因植株和筛 选稳定遗传的后代，并对培育出的转基因作物新品种进行包括分子特征分析、环境安全性、食用安全性三个方面的安全性评价； 另一方面，转基因安全管理部门 及监测机构，必须有一套高效、准确、快速的检测技术，使安全性审批、强制标 识、进出口等监管工作得以贯彻实施。 本文就国内外转基因作物发展概况、 安全 管理现状作了简要介绍，重点对转基因作物及产品的检测技术研究进展进行了综 述，并提出了今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。1转基因作物

2、及产业发展概况自1996年转基因作物(GMCW始商业化种植以来，全球转基因作物及其产业 发展迅猛，产生了巨大的经济效益。根据农业生物技术应用国际服务组织 (ISAAA)2007年度报告，转基因作物种植面积从1996年的170万hm2到2007年 的1. 143亿hm2增长了 60倍。种植作物的国家达到23个，另有29个国家同 意转基因作物作为食品和饲料进口，或进行环境释放试验，目前共有23种转基因作物的1247个项目获得615项批准。2006年全球转基因作物种植者的净收益 是70亿美元，19962006年期间的累计收益达340亿美元。在我国，目前批准 商业化种植的转基因作物有抗虫棉、延迟成熟及

3、抗病毒番茄、抗病毒甜椒和线辣 椒、改变花色的矮牵牛以及抗病毒木瓜，其中抗虫棉的种植面积最大。2006年我国转基因作物种植面积达350万hm2是转基因作物种植第六大国。2转基因作物安全管理现状然而转基因生物（GMO在给人类带来诸多好处的同时，具安全性问题一直备 受争议。1998年，英国Rowett研究所的Pusztai博士在电视台发表讲话，声称 大鼠食用转雪花莲凝集素基因的马铃薯后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到破坏。此后，又相继发生了斑碟事件、加拿大“超级杂草”事件、墨西哥玉米事 件、中国Bt抗虫棉事件、转基因大豆中多余未知 DNA件等一系列重大的转基 因事件，引发了国际社会对转基因作物及其

4、产品对人类健康和生态环境影响的激 烈争论和广泛关注。尽管后来的调查证明，这些事件中所得结论缺乏科学依据， 而且目前批准商业化的转基因作物及其产品尚没有发现有安全性问题，但转基因作物的应用毕竟只有短短的10年，其潜在的风险和非预期效应不能不让人们担 忧。为了加强对转基因作物的管理，世界各国纷纷制定了相应的法律法规。1998年6月欧盟规定对农作物的种子、食品和饲料贴示标签，必须标示其是否含有 GMO随后又规定转基因成分超过1%时实行强制性标识制度，2002年欧盟执行 新的转基因产品管理法规，要求对转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全 程的跟踪、检测。到目前为止，已有包括欧盟国家在内的40多个国

5、家和地区制定了相关的法律和法规，要求对转基因生物及其产品（包括食品和饲料）进行标识 管理。在我国，2001年5月国务院颁布了农业转基因生物安全管理条例， 将研究试验、生产、加工、经营和进出口各环节都纳入了农业转基因生物安全管 理的范畴。2002年以来，农业部先后发布了与之配套的 4个管理办法，即：农 业转基因生物安全评价管理办法、农业转基因生物进口安全管理办法、农 业转基因生物标识管理办法和农业转基因生物加工审批办法。这些法律、法规的实施，标志着中国农业转基因生物安全管理进入法制化、规范化的管理轨 道。3转基因检测技术为使外源基因在导人植物中高效表达且易于筛选，在构建表达载体的时候常加上能在植

6、物细胞中表达的各种启动子、终止子和标记基因。据统计.有80%90%商业化转基因作物使用了 CaMV35SFMV35Sg动子，90%以上的转基因作物 使用了 NO繁止子与NPTI标记基因。在转基因玉米、大豆、油菜中使用比较广 泛的抗虫基因是CrylA(6),抗除草剂基因EPSP辞口 PAT因此可以检测材料中是 否含有外源启动子、终止子、标记基因、目的基因及其表达产物来判断是否含有 转基因成分。目前，国际上还没有统一的转基因作物及其产品的标准化检测方法。 综合各国的检测方法，主要有两种类型，即基于外源基因表达产物一蛋白质检测 和基于外源基因插入的DNA佥测。3. 1外源蛋白质检测蛋白质检测是利用免

7、疫化学原理，将外源基因表达的蛋白质制备抗体， 根据 抗原抗体特异性结合和酶对底物的高效催化的原理，从而达到检测目标蛋白的目的。主要有酶联免疫吸附法(Enme linked immunosorbent assay , ELISA)、试 纸条，以及Western杂交技术等。其中，ELISA试剂盒是到目前为止转基因检测 系列产品最成熟的商业化试剂盒产品，检测灵敏度高于0. 1%,具有可定量分析、操作简单、易自动化等优点。而试纸条法检测表达蛋白的最低值可达到 O. 15%,且简单、快速、易操作，可随身携带。目前已开发出针对检测抗除草 剂的莽草酸羟基乙酰转移酶(EPSPS草丁瞬乙酰转移酶(PAT)以及抗

8、虫的Bt毒 蛋白（CrylAc , Crylc , Cry3a, Cry2A, cry9c编码产物）等多种商业化检测试剂盒和试纸条出售。Western 杂交是植物基因工程中检测外源基因是否表达出蛋白质的权威方法。但该方法需要转膜及杂交，操作繁琐且费用高，不适合大批量样品的检测。由于外源基因的表达有组织特异性，对一些诱导型基因表达的蛋白质在特定的材料中无法检测；而且因为蛋白质容易在加工过程中变性，因此不适用于深加工产品的检测，只适用于原材料和浅加工产品的检测； 需要制备特异的抗体，制 备过程繁琐。这些因素都极大的限制了其在转基因检测方面的应用。3. 2外源DNA佥测主要有分子杂交技术和PCR技术

9、。分子杂交技术主要包括Southern和Northern杂交，分别从整合、转录水平检测外源基因的行为，准确度高、特异性强，但需要转股及杂交，操作繁琐、费用高，不适合大批量样品的检测，一般仅用于对PCR吉果的验证。PCR（Polymerase Chain Reaction）技术，是目前转基因检测中应用最广泛的技术，具有快速、简便、灵敏等诸多优点。3. 2. 1定性PCR PC检测必须事先了解转入基因的 DNAff列、转基因生物的分子结构等详细信息，在此基础上设计适当的引物。根据引物特异性，PCR检测可以分为4种类型：一是筛查，根据启动子、终止子、标记基因及报告基因序列设计引物进行PCFT增，目前

10、使用比较广泛的有 CaMV35昭动子、NO繁止 子、选择标记基因如Kmr（抗卡那霉素基因）、Neor（抗新霉素基因）、Hygr（抗潮 霉素基因）、Barr（抗草丁麟基因）、报告基因如NPTH （新霉素磷酸转移酶基因）、 GUS（葡萄糖醛酸酊酶基因）等，但只能判断是否为转基因作物，不能鉴定转入的基因类型。二是根据目的基因序列设计引物， 对目的基因直接检测，可以鉴定转入基因的类型，但同一种基因稍加修饰后可能导入不同的作物种类。三是构造检测，根据目的基因与邻近的调控元件之间的序列设计引物，特异性更强，但整个基因结构可能会转入更多的品种中，如转基因玉米Mort809含有pV-ZMBK07 和pVZMG

11、Tl咯1个拷贝.Mon810含1个拷贝的pV-ZMBK07 Mon832含1个拷贝 PVZMGT10而Mon8010附未知拷贝数且可能是其它的质粒载体。四是品系特异 性检测，因为在现在的技术条件下外源基因是以随机的方式插入作物基因组的， 因此每个品种中外源DNAf寄主DNA吉合位点和边界序列应该是唯一的，根据边 界序列设计引物，从而可以鉴定出转基因作物的品系，目前已建立了转基因玉米 Btll、Mon 810、CBH-351(Starlink)和抗除草剂大豆的品系特异性鉴定方法。在常规PCR的基础上发展了多重PCR(MPCR) PCR-ELISAK术。多重PCR 即在转基因检测中，可在同一个反应

12、管中对CaMV35SO动子、NOS终止子、CrylA(6)、Bar等基因同时检测，不但提高了检测效率，降低了检测成本，还能 有效防止假阳性。Mmsuok咻建立了 5种转基因玉米的多重PCR佥测方法，其检 测低限为O. 5%0PCR-ELISA一种将PCR勺高效性与ELISA的高特异性结合、用免疫学方法 检测PCR物的检测方法。与常规电泳方法检测 PCRT物相比，PCRH ELISA大 大提高了准确性和灵敏度，并且可同时处理大量样品，便于实现自动化；若加入 内标，做出标准曲线，可实现半定量检测。Hans-Josef Brunnert等通过检测CaMV-35s启动子建立了转基因抗除草剂大豆及大豆粉

13、的PCR-EHSAf法，可检测低至O. 1 %的转基因成分；Laetitia Petit等用该方法建立了从玉米粉和淀粉中检测和鉴定转基因玉米Btl76的方法。3. 2. 2定量PCR目前许多国家实行了转基因产品标识制度，规定了转基 因成分的最低含量阈值，如欧盟是 O. 9%,日本、俄罗斯等国是5%,因此就必 须对转基因产品进行定量检测。为此国际上已发展出以植物内源基因(内标)作参 照的数量竞争PCR(QC-PCR)实时荧光定量(Real-time)PCR 技术。数量竞争PCR(QC-PCR)将内标(竞争DNA疗待测DNA1行共扩增，因竞争 DNA>t断和待测DNA勺大小不同，经琼脂糖凝胶

14、可将两者分开，并通过竞争DNA扩增产物和转基因成分扩增浓度的比对进行定量分析。QC-PCR寸实验仪器要求不高，不足之处是需要用基因重组技术构建内标竞争DNA对一般实验室来说难度较大，但如果将其商业化，可从生物公司直接购买，则在一些已有能力检测 GM密量的实验室都可进行，因而是一种很有推广价值的定量检测方法。目前已 建立了对 CaMV353动子、NO腔止子、Roundup Ready大豆、Btll、Btl76 玉 米等转基因产品的竞争性PCR佥测方法。实时荧光定量PCRK术是在PC就应体系中，添加一条5'端标记荧光报告 因子、3'端标记荧光猝灭因子的探针(如Taq man),当两

15、者距离相近时，荧光 受到抑制而检测不到信号，当两者距离较远时，抑制作用消失，荧光信号增强， 荧光信号在PCRS程中随着产物的增加而增强，这样就可对PCRT增全过程进行 实时动态监测，最后通过与标准曲线比对对未知模板进行定量分析。陈颖等采用实时荧光定量技术，通过使用特异的引物和探针，对转基因大豆和转基因玉米 Mon810 Eventl76中的外源基因进行了定量检测，灵敏度达 0. 01%,是国际上 设定的转基因最低限量的100倍，已完全能够满足转基因检测的需要。 实时荧光 定量PCR具有特异性强、灵敏度高，准确可靠、高效快速等优点，但所需仪器和 试剂昂贵，这是限制该技术应用的主要因素。3. 3其

16、它检测技术3. 3. 1基因芯片(Gene chip)技术 在转基因检测中，将目前通用的报告基 因、抗生素抗性标记基因、启动子和终止子的特异片断制成检测芯片与待测产品 的DNA!行杂交，杂交信号由扫描仪扫描后再经计算机软件进行分析，就可以判断待测样品是否为转基因产品。Serge Leimanis等建立了同时对Btll、Starlink、MON810GA21 T25、T45、Topasl9/2和转基因大豆9种转基因作物的 CaMV35SNO索止子、NPTI标记基因3种元件进行检测的基因芯片技术，经 5个实验室 测试，检测灵敏度可达0. 1%- Q 3%。基因芯片技术具有高通量、灵敏度高、 特异性

17、强、假阳性率和假阴性率低、操作简便、自动化程度高等特点，是一种在 转基因检测中极有发展前景和应用价值的技术，也是近年来国内外研究的热点。3. 3. 2近红外光谱扫描技术、色谱技术针对转基因作物中如蛋白质含量、 氨基酸组成、油分含量以及纤维结构等的改变，可采用近红外光谱扫描技术、色 谱技术进行检测，该方法具有操作简单、成本低、无污染、快速、高效的特点。芮玉奎等对24个转Bt基因玉米及其亲本材料、转基因油菜及其亲本进行了近红 外分析，结果显示通过扫描光谱及数学和计算机软件分析，非常准确、方便地识别了转基因农产品；Lijuan Xie等利用近红外广谱和化学计量方法对转基因番 茄进行非损伤鉴定，结果表

18、明该方法可以方便地将转基因和非转基因番茄分开。Roesnner等用GJ M的析技术，对转基因与非转基因马铃薯块茎中150种化合 物进行了定性和定量分析。4转基因检测技术存在的问题和发展方向目前，应用最广泛的是以PCR为基础的转基因检测技术，但该方法面临着两 个方面的挑战：特异性的引物设计和高质量模板 DNA勺获得，这是保证PCR佥测 成功的两大关键因素。为了维护自己的商业利益，研发单位往往不会将遗传改造 的序列信息，特别是基因序列信息对外公布，这给转基因产品的检测带来了很大 的困难，因此研究获得外源基因插入的序列信息是非常必要。另一方面，由于深 度加工使原料DNAft加工过程中遭到严重破坏，加工中出现的某些物理、化学或 酶因子也会影响DN颇量，深加工品中常含有阳离子(如Ca2+K Mg2+微量重 金属、碳水化合物、单宁酸、酚类、盐分、亚硝酸盐等物质均能抑制 PCR佥测反 应，这些抑制剂也常因食品种类不同而差异很大， 如火腿几乎不含有抑制剂，而 奶酪则完全抑制PC阪应，需要依据深加工品的种类和其中可能存在的 PC阪应 抑制剂采取不同的DNAI取方法，以降低或消除这些抑制