6、洁净环境验证

1、 洁净环境验证 主讲：柴海毅 洁净环境控制的两个主要方面：1、尘埃粒子2、微生物 洁净室环境监测主要方面：1、尘埃粒子监测洁净级别的划分：n中国2010GMP洁净级别的划分和欧盟GMP基本一致。nFDA Guidance for Industry nISO 14644洁净级别对比：GMP （2010年版）附件1欧盟GMP附录一（2003） 美国FDA 2004 ISO 14644-1 静态(b) 动态 区域 动态 级别 动态 粒径0.5m 5m 0.5m 5m0.5m 0.5m A(a) 3,500 1 3,500 1 关键 3,520 5 3,520 B(a) 3,500 1 350,000

2、 2,000 支持352,0007 352,000 C(a) 350,000 2,000 3,500,000 20,000 8 3,520,000D(a) 3,500,000 20,000 -(c) -(c) 医药工业洁净室最大允许空气悬浮粒子数(个/立方米) 尘埃粒子测试依据：n现状： 采用GB/T16292-2010 医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法nGMP 2010年版 测试方法可参照ISO14644-1 测试状态：n静态n动态采样点位置要求：采样点数目要求：ISO14644的规定，采样点数洁净室面积 采样量的要求：1、采样量要足够大，保证能检测出至少20个 粒子；2、每个采样点每

3、次的采样量至少为2升；3、采样时间最少为1分钟。采样量的对比：采样量计算方法：n依据：ISO14644-1 n最小采气量（立方米） 20（个）某直径粒子的限度 标准（个/立方米） 例如： A级区5m粒子的标准是：20个/M3 A级区最小采气量20个20个/ M3 1 M3 B级区5m粒子的标准是：29个/ M3 B级区最小采气量20个29个/ M3 0.69 M3 690L C级区5m粒子的标准是:2900个/ M3 C级区最小采气量20个2900个/ M3 0.0069 M3 6.9L D级区5m粒子的标准是29000个/ M3 D级区最小采气量20个29000个/ M3 0.00069 M

4、3 0.69L尘埃粒子计数器的选择：nA级区、B级区测试： （1）如果采用2.83升/分钟的检测仪器，每次采样的 时间过长了（1000L2.83L/分钟350分钟）。 （2）如果选用28.3L/分钟的，每次采样需35分钟， 对于面积小、采样点少的洁净区，是可以符合 要求。（1000L28.3L/分钟35分钟）。 所以要选择大流量的尘埃粒子计数器。尘埃粒子计数器的选择：nC级、D级区测试时： 最小采气量大于6.9升即可，此时选择传统的2.83升/分钟的检测仪器就能达到要求，每次采样的时间不超过3分钟而已。 （6.9L2.83L/分钟2.44分钟）。 如果只测试C级、D级区，选择普通小流量的粒子计

5、数器就满足要求。新要求：尘埃粒子在线监测尘埃粒子在线监测：等动力取样洁净室环境监测主要方面：2、微生物监测洁净区微生物监测的动态标准洁净区微生物监测的动态标准（GMP2010版）版）洁净度级别浮游菌cfu/m3沉降菌（90mm）cfu /4小时表面微生物接触（55mm）cfu /碟5指手套cfu /手套A级1111B级10555C级1005025D级20010050微生物测试依据：nGMP2010年版 & EU GMPnGB/T 16293-2010 医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法nGB/T 16293-2010 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法nUSP nISO14644

6、无微生物限度的标准洁净级别浮游菌CFU/m3 空气沉降菌(90mm4小时) 表面微生物CFU/接触碟(25cm2)*手套(五指)表面(CFU/手套) A 1 1 1 1 B 10 5 5 5 C 100 50 25 - D 200 100 50 - 欧盟GMP 附录1. (2003) 医药工业洁净室建议最大允许的微生物含量 级别浮游菌 (CFU/m3) 设施表面微生物(CFU/接触碟*) 人员卫生 (CFU/接触碟*) 惯用 SI制 手套 操作服 100 M3.5 3 3 (包括地板) 3 5 10,000 M5.5 20 5 (一般表面)10 (地板) 10 20 100,000 M6.5

7、100 - - - USP29 医药工业洁净室建议最大允许的微生物含量(动态) 洁净室微生物监测的三个方面：第一、浮游菌第二、沉降菌第三、表面微生物环境微生物控制和评估原则：环境监测取样点的设置：应该考虑但不局限于以下因素：n该点最易受微生物污染，很有可能对产品质量造成不良影响n该点在实际生产中微生物便于微生物繁殖n统计学上的要求n该点不易清洁、消毒n房间的洁净度级别n可能污染产品的采样点采样点示例：系统采样点洁净空气近开放口/灌装头室内空气靠近工作区生产用水使用点表面（设施）地面、门把手、墙面、容器表面表面（设备）灌装线、控制面板、胶塞容器压缩空气距离压缩机最远端无菌试验装置靠近真空源处灌装

8、线操作人手指取样层流空气活动频繁处浮游菌监测：n采样点的位置浮游菌监测n最小采样量沉降菌监测n采样点的位置 a) 工作区采样点位置离地0.8m1.5m左右（略高于工作面） b) 可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。沉降菌监测n最小培养皿数沉降菌测试时间n沉降平皿的暴露时间不少于4小时；n如果同一位置使用多个沉降平皿进行监测并累计计数，单个沉降平皿的暴露时间可以少于4小时。表面微生物监测包括：n设备表面n墙面n地面n洁净服表面表面微生物取样点设置 取样点 设置原则设备表面是否与产品接触墙面 距离地面高度约1.2-1.5m处地面房间中央，人员活动较多处洁净服表面袖口，肘部，胸前等控制微生物污

9、染的途径：1、有效地阻止室外的污染侵入室内。2、迅速有效地排除室内已发生的污染。3、控制污染源，减少污染发生量。防止和消除微生物污染的措施：压差压差的监测风速层流与高效的比较：例如：HEPA送风口面积为1m2，送风的风速为0.45m/s， 层流到工作面的距离为0.02m；高效到工作面得距 离为2m。每小时送风量相当的换气次数： 层流换气：0.45m/s X 3600s X 1m2 = 1620 m3 1620 m3/ (1m2 X 0.02m) = 81000次/小时 高效换气：0.45m/s X 3600s X 1m2 = 1620 m3 1620 m3/ (1m2 X 2m) = 810次

10、/小时 相同级别下，层流与高效相差相同级别下，层流与高效相差100倍。倍。环境监测频率：环境监测频率：环境控制计划和实施：环境控制计划和实施：环境监测培养基的选择微生物总数n细菌数：在细菌培养基上菌落形成单位的平均数。n真菌数：在真菌培养基上菌落形成单位的平均数。微生物总数 = 细菌数 + 真菌数细菌、真菌培养基：中国药典欧洲药典细菌营养琼脂3035 3天TSA3035 5天霉菌、酵母菌玫瑰红钠琼脂2328 5天SDA2025 5天酵母菌酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂2328 5天/GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010n采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，

11、在30 35 培养箱中培养，时间不少于2d；n采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在20 25 培养箱中培养，时间不少于5d。微生物计数的困惑 ！n细菌培养基上生长的真菌如何计数？n真菌培养基上生长的细菌如何计数？总好氧微生物数（TAMC）：定义：在TSA（大豆酪蛋白琼脂）培养基上 生长的包括真菌的菌落形成单位总的 数量。培养温度/时间： 1、细菌： 3035 5天。 2、细菌： 3035 2天； 霉菌或酵母菌： 2025 3天。酵母菌和霉菌总数（TYMC）：定义：在SDA（沙氏葡萄糖琼脂）培养基上 生长的包括细菌的菌落形成单位总的 数量。培养温度/时间： 2025 5天。计数原则：

12、1、TAMC时，如果真菌被发现生长，应该被 作为TAMC计数的一部分。2、TYMC时，如果细菌被发现生长，应该被 作为TYMC计数的一部分。 3、当TYMC由于细菌的生长而超过了可接受 标准，应当使用含有抗生素的SDA培养基。培养条件：CHP2010中国药典2010年版 二部 附录附录XIX XIX Q Q “药品微生物实验室规范指导原则药品微生物实验室规范指导原则” 用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。微生物良好实验室规范假阳性（False positiv

13、e）n测试结果实际应该没有微生物生长，但被 判为发现生长或阳性。n产生原因： 1、非无菌培养基平板引人污染； 2、非无菌操作带来污染。 假阴性（False negative）n测试结果实际应该有微生物生长，但被判 为未见生长或阴性。n产生原因： 1、培养基选择不正确； 2、培养基促生长试验失败； 3、培养条件不正确。 GB/T 16293-2010 / GB/T 16293-2010附录B:B.3 培养基平皿培养及保存 制备好的培养基平皿宜在28保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜的方法在平皿上做好培养基的名称、制备日期剂量的标记。 环境测试培养基：1、TSA（大豆酪蛋白琼脂）

14、 用于细菌取样。 培养温度/时间：3035 不少于2天。2、 SDA（大豆酪蛋白琼脂） 用于霉菌和酵母菌取样。 培养温度/时间：2025 不少于5天。环境测试培养基：3、用户认可并验证了的培养基。 以上摘自：GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010环境监测中常忽视的两个方面：1、忽视洁净环境中的影响因素2、忽视培养基的选择1、忽视洁净环境中的影响因素（1）API 的残留（2）消毒剂/杀孢子剂的残留APIn抗菌素n药物活性成分 消毒剂/杀孢子剂常见的化学消毒剂：1、酚类2、醛类3、过氧化氢类4、季胺盐类化合物5、以上混合物2、忽视培养基的选择（1）选择性低下，营养全面（2）

15、含有中和剂（3）“无菌”平板培养基培养基的选择n营养琼脂、虎红琼脂n胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）中和剂的使用：参见：“中国药典”2010年版 附录109页附录XI J 表1：“常见干扰物中和剂或灭活方法”酶（1）：青霉素酶n青霉素酶（ -内酰胺酶） 可以有效的水解-内酰胺类抗生素。 包括： - 青霉素G - 氨基青霉素类，如氨苄西林、阿莫西林、匹氨西等 - 羧基青霉素类，如羧苄西林、替卡西林等 - 脲基青霉素类，如呋苄西林、美洛西林等 - 头孢、酶（2）：头孢菌素酶n头孢菌素酶 可以可有效水解头孢类抗生素及以上的头孢类 抗生素。 包括：头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢克洛、头孢呋辛、 头孢克肟、头孢哌

16、酮、头孢噻肟、头孢曲松等。抵抗消毒剂的中和剂：1、吐温、吐温-80 能够消除六氯酚和含汞类消毒剂的影响。2、卵磷脂、卵磷脂 能够消除洗必泰类消毒剂的影响。3、卵磷脂、吐温、卵磷脂、吐温-80 能够消除季胺类化合物（苯扎溴铵、苯扎 氯铵等）消毒剂的影响。 理想的环境测试培养基：n无菌平板培养基 （预灌装无菌培养基）无菌平板培养基优点：1、A级、B级、C级洁净区直接使用2、室温储存3、有效期长4、无菌包装、包装完整5、特制平板6、培养基灌装量大55mm接触平板（Rodac Plate） Replicate Organism Detection and Counting GMP2010 和和 EU GMP: - 平板尺寸：15 X 55 mm - 取样单位面积：25cm2 USP1116 洁净室和其它控制环境的微生物评估 n接触板得取样面积： 2430cm2 ISO 14698 洁净室及其相关控制环