内皮微粒通过携带miR

1、内皮微粒通过携带 miR-155调控T细胞功能参与异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的体内外研究第一部分微粒携带的 miR-155 在异基因造血干细胞移植受者急性移植物抗宿主病的表达及意义目的：研究微粒（MPs）携带的microRNA-155（miR-155）在急 性移植物抗宿主病（aGVHD患者中的表达水平及意义。方法：采用实时定量聚合酶 链反应（qRT-PCR检测28例行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗后发生 aGVHD!者及30例未发生aGVHD非aGVHD患者各时间点（移植前、+7天、+14 天、+21天、+28天及aGVHDg生时）外周血MPs血浆中miR-155

2、的表达水平； 采用T细胞分选试剂盒分离aGVH皈非aGVHD!者上述时间点外周血中T细 胞,qRT-PCR方法检测两组患者各时间点T细胞中miR-155的表达水平；比较两组 患者各时间点外周血 MPs血浆及T细胞中miR-155表达水平的差异；比较aGVHD 患者各时间点MPs血浆及T细胞中miR-155表达水平的差异。结果：与移植后非aGVHD!者比较,aGVHD患者在+7天、+14天、+21天、+28 天时外周血MPs血浆中miR-155的表达水平明显升高，且外周血MPs中miR-155 的表达水平升高更显著；对于aGVH患者而言，外周血MPs中miR-155的表达水平 在+7天、+14天

3、、+21天、+28天及aGVH发生时较移植前明显升高,血浆中miR-155 的表达水平在+7天、28天及aGVHDg生时较移植前明显升高；移植后非aGVHD 与aGVHD!者T细胞中miR-155的表达水平在移植前、+7天、+14天、+21天、 +28天均无明显差别，aGVHD患者T细胞中miR-155的表达水平在aGVH发生时显 著高于移植前水平。结论：外周血中MPs携带的miR-155可在aGVHDS状出现之 前早期预测aGVH啲发生，可作为诊断及预测aGVH啲敏感的生物学指标。第二部分内皮微粒携带的miR-155对T细胞功能的影响及其作用机制的体外 研究目的：在体外实验中探讨内皮微粒(E

4、MPs)携带的microRNA-155(miR-155)对T细胞生物学功能的影响及其作用机制。方法：采用实时定量聚合酶链反应 (qRT-PCR)比较肿瘤坏死因子-a (TNF- a )刺激人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)EA.hy926细胞产生的EMPs及 EA.hy926细胞中miR-155表达水平的差 异；采用激光共聚焦显微镜观察携带 miR-155的EMPs双荧光标记的EMPs与 T 细胞的融合过程；使用内皮细胞保护剂辛伐他汀预先处理EA.hy926细胞，设计合成miR-155特异性抑制剂antagomir-155,并将其转染至 EA.hy926细胞,下调 miR-155的表达,后使用

5、TNF-a刺激各组EA.hy926细胞产生EMPs实验设置正常 对照组,EMPs组，辛伐他汀-EMPs组,antagomir-155-EMPs组,antagomir-NC-EMPs组,将五组EMPs分别加入T细胞，作用72小时后,qRT-PCR检测T细胞中miR-155的表达;CFSE检测T细胞的增殖；Annexin VFITC/PI双染法流式细胞术检测 T细胞的凋亡;Western blot 检测T细胞中凋亡 相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达；酶联免疫吸附测定(ELISA)检测T细胞 培养上清中细胞因子的含量；流式细胞术检测T细胞亚群的分化。结果：TNF-a刺激EA.hy

6、926细胞产生的EMPs中 miR-155的表达水平明显 高于EA.hy926细胞本身miR-155的水平；激光共聚焦显示双荧光标记的携带 miR-155的EMP可进入T细胞胞浆；辛伐他汀可明显减少 TNF-a刺激EA.hy926 细胞产生的EMPs从而改变T细胞中miR-155的表达水平；抑制EMPs中的 miR-155可明显降低T细胞中miR-155的表达水平；阻断EMPs中 miR-155不影 响T细胞的增殖；抑制EMPs中 miR-155不影响T细胞的凋亡及凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达；阻断EMP中 miR-155可显著抑制T细胞向Th1、Th9、Th17

7、细胞分化,促进T细胞向Th2及Treg细胞分化。结论:EMPs可携带 miR-155进入T细胞胞浆,不影响T细胞的增殖及凋亡，但促进T细胞向Th1、Th9、 Th17细胞分化,抑制T细胞向Th2及Treg细胞分化。第三部分内皮微粒携带的miR-155参与aGVH及其作用机制的体内研究目的：在体内实验中探讨内皮微粒（EMPs）携带的microRNA-155（miR-155）参与急性移 植物抗宿主病（aGVHD的作用及其相关机制。方法:构建同种异体造血干细胞移植 后aGVHDb鼠模型,流式细胞术检测单纯骨髓细胞（BM）组及aGVHD!小鼠不同时 间点（移植前、+4天、+8天、+12天、+16天及a

8、GVHDg生时）外周血EMPS的含 量及其变化；采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR检测BM组及aGVH组小鼠上 述不同时间点外周血微粒、血浆及 T细胞中miR-155的表达水平：后将实验分为 八组：BM组:给予全身照射（TBI）后的BALB/c受鼠输注C57BL/6供鼠的骨髓细 胞；aGVH组:给予TBI后的BALB/c受鼠输注C57BL/6供鼠的骨髓细胞及脾脏 细胞混合物；EMPSfi:将TNF-a刺激小鼠主动脉内皮细胞（MAECs产生的EMPs 给予aGVHD、鼠;辛伐他汀-EMPs组:将TNF-a刺激辛伐他汀（2.5卩mol/L）预先 保护的MAEC細胞产生的EMPs合予aGVHD

9、b鼠;antagomir-155-EMPs组：将 TNF-a刺激预先转染 antagomir-155 的MAECs细胞产生的EMP&合予aGVH小 鼠；antagomir-NC-EMPs组：将 TNF-a 刺激预先转染 antagomir-NC 的 MAECs田 胞产生的EMPs合予aGVHD、鼠;antagomir-155 组：向aGVHD小鼠尾静脉输注 antagomir-155;antagomir-NC 组：向 aGVHD、鼠尾静脉输注 antagomir-NC;+7 天时给予antagomir-155或antagomir-NC 25mg/kg,以后每周尾静脉注射两次, 每次5m

10、g/kg,直至移植后+21天；各组EMPs（60卩g/天）均在0天及+7天给予aGVHD 小鼠；观察各组小鼠生存期及aGVHDb现的差异;HE染色观察各组小鼠脏器病理 变化；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测各组小鼠血清中Th 1（IFN- 丫、TNF-a ）、Th2(IL-4 、IL-6 、IL-10) 、Th9(IL-9) 、Th17(IL-17A) 细胞因子的含量 ; 流式细胞 术检测各组小鼠外周血 T 细胞亚群分化的情况。结果：aGVH小鼠外周血EMP啲比例在移植后+8天、+12天及+16天显著高于BM组小鼠,在aGVH发生时稍下降；aGVH小鼠外周血MPs携带的miR-155 的表达

11、水平在+4天、+8天、+12天、+16天及aGVH发生时均显著高于BM组小 鼠,且aGVH小鼠外周血MPs携带的miR-155的表达水平明显高于血浆；aGVHD 小鼠外周血T细胞中miR-155在+16天及aGVH发生时均显著高于BM组小鼠；且 aGVHDb鼠外周血MPs中miR-155的表达高峰明显早于T细胞；尾静脉给予高 剂量EMPs可显著加重aGVHD勺表现，加重aGVHDg累器官的病理损伤,明显缩短 生存期,增加死亡率。尾静脉输注抑制 miR-155的EMPs可显著逆转上述现象。尾静脉给予TNF-a刺激辛伐他汀预先保护的 MAEC细胞产生的EMPi可改善 aGVH的表现,减轻aGVHD目关病理损伤,明显延长生存期，降低死亡率；尾静脉 给予高剂量EMPs使 aGVHDf、鼠血清中Th1、Th9及Th17型细胞因子含量升 高,aGVHD、鼠CD4+/CD8+T田胞及Th